根據萌發率和出苗率篩選高粱種子萌發期耐低溫材料

張麗霞+張靈敏+霍巖

摘要：將從全球收集的631份高粱材料進行8 ℃低溫脅迫處理14 d，再統計種子相對萌發率和相對出苗率；再將相對萌發率和相對出苗率都達到一級的49份材料進行6 ℃低溫處理，相對萌發率和相對出苗率都達到一級的材料有6份，隨后進行4 ℃低溫處理。結果顯示，8 ℃低溫處理對相對出苗率影響較小，但加重了后續篩選工作壓力；4 ℃低溫處理對相對萌發率影響較大，大部分材料都不能萌發，篩選條件苛刻且容易遺漏部分優良材料。因此，綜合考慮萌發率和出苗率時，初步篩選高粱種子萌發期耐低溫材料時選擇6 ℃低溫處理14 d較為適宜。

關鍵詞：高粱；種子萌發；低溫脅迫；相對萌發率；相對出苗率；耐低溫；種質資源

中圖分類號：S514.02 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0080-04

高粱是喜溫作物，生長發育的不同時期都容易遭受低溫的影響，給高粱生產帶來較大損失[1-2]。國內外關于高粱低溫方面的研究報道較少且不夠深入，國內的研究主要是關于高粱萌發期、芽期和苗期耐低溫材料的篩選和鑒定[3-8]，國外的研究更多的是關于高粱耐低溫QTLs的挖掘[9-11]。高粱在播種的早春階段經常遭遇低溫，影響種子萌發導致出苗率低或在土壤中“粉種”、霉爛，這是造成高粱減產的重要因素之一[12-13]。前人的研究結果表明，高粱萌發的下限溫度在各品種間有很大差異，基本在4～8 ℃之間[3-4，14]。關于高粱萌發階段耐低溫材料篩選、鑒定的方法主要包括種子低溫脅迫下的萌發率以及種子低溫處理后統計出苗率。龔文娟等利用人工氣候箱對從黑龍江省省內收集的407份高粱進行種子萌發階段的篩選試驗，將供試材料分別在<5、5、6、7、8、9、10、>10 ℃ 處理14 d后統計種子的萌發率[3]。陳香蘭等對黑龍江省471份高粱材料進行種子萌發階段的低溫處理，將供試材料低溫冷水浸種24 h后置于4 ℃人工氣候箱中處理7 d，然后于25～30 ℃下處理3～5 d，統計萌發率[5-6]。馬世均等選取國內外不同生態類型的高粱材料115份，分別置于8、6、4 ℃條件下處理，19 d后統計萌發率[4]。張桂香等將來自美國、印度和中國等不同地區的168份高粱材料種于小盆內，置于1～2 ℃的智能培養箱中處理 5～8 d，然后調試溫度至 12～15 ℃，根據出苗率篩選種子萌發階段耐低溫材料[7，15]。雖然低溫條件下種子的萌發率是衡量耐低溫的重要指標，但是最終的出苗率才是人們更關注的結果。因此，衡量萌發階段的耐低溫特性應綜合考慮種子的萌發率和出苗率。因此，本研究利用人工氣候箱對從中國及其他世界各地收集的631份高粱材料進行種子萌發階段耐低溫篩選、鑒定，綜合考慮相對萌發率和相對出苗率從中篩選出優良的耐低溫材料，且提出適宜的高粱種子萌發期耐低溫材料篩選條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗收集了中國以及世界其他不同地區（非洲、亞洲、美洲和北美洲等）、不同類型（甜高粱、粒用高粱、草用高粱、帚用高粱和國內農家種）的高粱材料631份，其中包括國際熱帶半干旱地區作物研究所（ICRISAT）提供的微核心種質243份，中國國家作物種質庫中期庫提供國內農家種251份，遼寧省農業科學院創新中心國家高粱改良中心提供甜高粱、草用高粱和國內常規品種等136份和通遼市農業科學研究院提供選育品種1份。

1.2 試驗方法

利用國產MGC-350HP-2型人工氣候箱（上海一恒科學儀器有限公司），對收集到的631份高粱材料進行8 ℃低溫脅迫處理，14 d后統計種子的相對萌發率，隨后置于25 ℃下統計相對出苗率。萌發以種子露白為標準，出苗以2張子葉完全展開為準。

具體操作步驟為：選取籽粒飽滿、均勻一致且無病蟲害的風干種子100粒，放在墊有毛巾的發芽盒中，加入一定量的無菌水，使毛巾保持濕潤的狀態。將發芽盒置于人工氣候箱進行8 ℃低溫脅迫處理，14 d后統計種子的相對萌發率，隨后置于25 ℃人工氣候室的培養架上，5 d后統計相對出苗率。對照材料置于25 ℃培養架上3 d后統計種子的萌發率，萌發 5 d 后統計種子的出苗率。相對萌發率=（處理后種子的實際萌發率/對照種子萌發率）×100%；相對出苗率=（處理后種子的實際出苗率/對照種子出苗率）×100%。試驗重復 2～3次，求平均值進行統計，統計標準見表1。耐低溫級別達到一級的材料繼續進行6、4 ℃的低溫篩選，14 d后統計相對萌發率，隨后統計相對出苗率。

2 結果與分析

2.1 相對萌發率和相對出苗率

2.1.1 相對萌發率 供試631份材料中相對萌發率達到一、二、三、四、五、六級的樣品數分別為91、120、102、88、78、152份，占總樣品比例分別為14.42%、19.02%、16.16%、13.95%、12.36%、24.09%，相對萌發率幾乎較均勻地分布在不同的等級中（表2）。

2.1.2 相對出苗率 供試631份材料中相對出苗率達到一、二、三、四、五、六級的樣品數分別為308、157、72、45、34、15份，所占總樣品比例分別為48.81%、24.88%、11.41%、7.13%、5.39%、2.38%，相對出苗率達到一級和二級的為465份，占總材料的73.69%。

綜上所述，8 ℃低溫處理對種子的相對萌發率有較大的影響，這也表明低溫脅迫下材料之間的差異顯著。但是，8 ℃低溫脅迫14 d后，大部分材料的相對出苗率較高，8 ℃低溫處理對種子的相對出苗率影響較小。為了進一步說明相對萌發率和相對出苗率的關系，利用DPS數據處理系統分析了8 ℃低溫脅迫處理14 d后相對萌發率和相對出苗率的相關性，結果表明兩者之間并沒有相關性，即低溫脅迫條件下，種子相對萌發率高的材料相對出苗率不一定高，種子不萌發或相對萌發率低的材料相對出苗率不一定低。

2.2 8 ℃低溫處理下相對萌發率和相對出苗率維恩比較分析

在8 ℃低溫條件下，種子萌發率和出苗率之間的變化關系復雜，同樣存在萌發率高、出苗率也高的材料。如表2所示，根據相對萌發率和相對出苗率統計標準，已經將631份材料分別劃分到6個不同的等級中，利用維恩圖的形式將每個等級相對萌發率和相對出苗率的材料進行歸類分析，一、二、三、四、五、六級相對萌發率和相對出苗率共有的材料分別是49、39、20、7、2、5份，總計122份（圖1）。8 ℃處理后，相對萌發率較均勻地分布在6個等級中，而8 ℃低溫對最終的相對出苗率影響較小，相對出苗率主要集中在前3個等級中，占總材料的85.1%（表2）， 前3個等級中相對萌發率和相對出苗率共有材料108份，占總共有材料的88.52%。

低溫條件下，種子的相對萌發率和相對出苗率相關性較差，以相對萌發率和相對出苗率都達到一級的材料為例（圖2）， 相對萌發率達到一級的材料共91份，但相對出苗率差異卻很大，其中相對出苗率達到一級49份、二級23份、三級10份、四級5份、五級4份，分別占相對萌發率達到一級材料的53.85%、25.27%、10.99%、5.49%、4.40%，分析結果表明，91份一級材料相對萌發率和相對出苗率之間沒有相關性（圖2-A）。相對出苗率達到一級的材料共308份，相對萌發率差異更大，其中相對萌發率達到一級49份、二級44份、三級32份、四級44份、五級34份、六級105份，分別占相對出苗率達到一級材料的15.92%、14.29%、10.39%、14.29%、11.04%、34.09%（圖2-B）。308份一級材料相對萌發率和相對出苗率進行相關性分析，相關系數r為-0.192 5、P值為0.000 7（相關系數臨界值α=0.05時，r=0.111 8；α=0.01 時，r=0.146 6），達到極顯著負相關，表明即使低溫處理后相對萌發率較低或者根本暫不萌發的材料待溫度適宜時都有較高的相對出苗率。

2.3 6、4 ℃低溫處理下相對萌發率和相對出苗率比較分析

篩選較優良的耐低溫材料應綜合考慮萌發率和出苗率，

因此重點關注相對萌發率和相對出苗率都達到一級的49份材料（圖1和圖2）。將這49份材料進行6 ℃低溫處理，14 d后統計相對萌發率和相對出苗率，相對萌發率達到一級16份、二級6份、三級6份、四級6份、五級1份、六級14份，相對出苗率達到一級14份、二級24份、三級7份、四級3份、五級1份（表3），其中兩者共有的材料分別為一級6份、二級2份、其他級別為0（圖3）。將6 ℃低溫處理下相對萌發率和相對出苗率都達到一級的材料置于4 ℃低溫處理，14 d后統計相對萌發率和相對出苗率，只有來自中國的1份農家種材料萌發，相對萌發率僅為4.13%。即使種子在4 ℃低溫條件下沒有萌發，但2份來自南非的材料相對出苗率也達到75%以上，另外4份材料的相對出苗率在40%～50%之間，其中3份材料來自中國，1份材料來自美國（表4）。

3 討論

高粱是世界第五大重要的糧食作物，具有高產、抗旱、耐瘠薄、耐鹽堿、耐高溫、耐寒冷和抗澇等特點[16]，深入挖掘高粱抗逆基因對探究高粱高抗逆性的分子機制及大田實踐生產應用都具有非常重要的意義。目前，已經在高粱中應用全基因組關聯分析方法（genome-wide association studies，GWAS）定位不同農藝性狀基因[17]。水稻[18]、玉米[19]、小麥[20]和番茄[21]等作物對耐低溫資源的挖掘利用、耐冷相關基因的定位以及耐低溫種質在生產和育種上的應用都有較深入的研究。陳亮等通過珍汕97B與多年生水稻種質AAV002863構建的DH群體，QTL定位分析檢測到2個與低溫發芽力相關的基因座[22]。本研究詳細統計了631份高粱材料的相對萌發率和相對出苗率且筆者所在的實驗室已獲得這些群體材料的簡化基因組測序結果，利用全基因組關聯分析方法可以檢測到與低溫萌發力和出苗相關的SNP，為定位和克隆高粱種子萌發期耐低溫基因奠定基礎。

低溫條件下，如何真實統計種子的萌發率和出苗率敘述不一[3，15]，一種方法直接以實際萌發（出苗）種子數/萌發種子總數，這種方法簡單、工作量少，尤其能針對大批材料進行初步篩選，大部分材料在正常條件下萌發率都比較高，達到95%以上，低溫脅迫后即使采用這種方法統計萌發率、出苗率與實際出入較??；另一種方法是處理后種子實際萌發（出苗）率/對照種子萌發（出苗）率，有部分材料即使是當年的新種，在正常的條件下萌發率較低，有的只有80%左右，在低溫脅迫后采用這種方法統計能夠比較客觀地反映出低溫對種子萌發的影響。但是，篩選耐低溫優良的種質材料時，正常條件下萌發率較低的材料應舍棄，否則在大田生產中會加大種子的使用量和成本。

篩選種子萌發期耐低溫材料時，研究人員通常以種子的萌發勢、萌發率或者最終的出苗率為指標去篩選耐低溫材料[3，7，15]。以種子萌發勢和萌發率為指標篩選耐低溫材料時，有時會遺漏較優良的材料。經過以上的研究發現，低溫處理后，萌發率較低或根本不萌發的種子在溫度適宜時又重新萌發、出苗。實驗室內利用發芽盒進行種子萌發時，即使種子長菌也很少發生爛種的情況，低溫（8、6、4 ℃）處理14 d后，溫度越低對相對萌發率的影響越大，4 ℃時大部分種子難以萌發，但都有較高的相對出苗率。這種情況和大田實際有所不同，大田播種后遭遇低溫低濕后極易產生爛種的危險，出苗率往往很低。實驗室內模擬低溫處理，僅以種子的出苗率為標準篩選耐低溫種子也存在一定的風險性，實驗室內種子萌發率低或未萌發的種子雖然出苗率很高，但在大田中容易出現爛種現象。大田中大規模篩選耐低溫材料受氣候的影響和限制，很難重復、穩定進行。因此，建議實驗室內篩選耐低溫材料時，應綜合考慮萌發率和出苗率。

實驗室內模擬低溫條件下篩選高粱種子萌發期耐低溫種質資源時與大田實際有所偏差，選擇低溫處理條件時應慎重考慮。如表2和圖1所示，8 ℃低溫處理14 d后，對種子的相對萌發率影響較大，631份材料較均勻地分布在6個不同的等級中。然而對相對出苗率影響較小，主要集中在前3個等級中。這樣初步篩選到的較優良材料數量較多，增加了進一步篩選的工作量。4 ℃低溫處理14 d后，對種子的相對萌發率和相對出苗率影響都非常大，大部分材料種子都不能萌發，條件過于苛刻可能會遺漏優良的材料。因此，綜合考慮相對萌發率和相對出苗率時，初步篩選高粱種子萌發期耐低溫材料時選擇6 ℃低溫處理14 d為宜。

4 結論

利用從中國以及世界其他地區收集的631份高粱材料進行8 ℃低溫脅迫處理，14 d后統計種子的相對萌發率和相對出苗率，相對萌發率達到一、二、三、四、五、六級的樣品數分別為91、120、102、88、78、152份，所占總樣品比例分別為 14.42%、19.02%、16.16%、13.95%、12.36%、24.09%；相對出苗率達到一、二、三、四、五、六級的樣品數分別為308、157、72、45、34、15份，所占總樣品比例分別為48.81%、24.88%、11.41%、7.13%、5.39%、2.38%；其中相對萌發率和相對出苗率都達到一、二、三、四、五、六級的樣品數分別是49、39、20、7、2、5份，共計122份。

對8 ℃低溫處理達到一級標準的49份材料進行6 ℃低溫處理，14 d后統計相對萌發率和相對出苗率，相對萌發率達到一級16份、二級6份、三級6份、四級6份、五級1份、六級14份；相對出苗率達到一級14份、二級24份、三級7份、四級3份、五級1份，其中兩者共有的材料分別為一級6份、二級2份。對6 ℃低溫處理達到一級標準的6份材料進行 4 ℃ 低溫處理，其中只有1份材料萌發，且6份材料相對出苗率與8、6 ℃相比顯著降低。8 ℃低溫處理對相對出苗率影響較小，加重了后續篩選壓力。4 ℃低溫處理對相對萌發率影響較大，大部分材料都不能萌發，容易遺漏部分優良的材料。因此，綜合考慮萌發率和出苗率時，初步篩選高粱種子萌發期耐低溫材料時選擇6 ℃低溫處理14 d較為適宜。

致謝：對本研究材料的提供方遼寧省農業科學院創新中心國家高粱改良中心、國際熱帶半干旱地區作物研究所、中國國家作物種質庫中期庫和通遼市農業科學研究院表示感謝。材料收集過程中得到了國家高粱產業體系首席專家鄒劍秋老師的大力支持，特此感謝！

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