新型脫礦同種骨修復材料的骨誘導活性研究

尹曼莉，王耀宏，宋之言

上海蘭瑪生物材料有限公司（上海，200444）

0 引言

同種異體骨移植是目前臨床骨修復手術常用的方式，多年來受到廣泛關注。大量臨床應用證實同種異體骨移植的成功率接近自體骨［1-2］。隨著同種骨的大量應用，越來越多的新品種和制備工藝得到不斷完善和創新，尤其是脫礦骨基質（demineralized bone material DBM）。DBM 是一種經稀酸脫鈣、清洗、冷凍干燥等一系列處理的動物或人類骨，骨基質的成分主要為I 型膠原蛋白、少量的非膠原蛋白和各種細胞因子，已經在骨科［3-4］和口腔科［5］領域得到了廣泛應用。

DBM 系列產品，包括脫礦骨粉、脫礦骨纖維、脫礦骨膠等。每種產品的誘導能力不同［6-7］，其中骨纖維作為一種新型DBM，具有良好的骨誘導能力。因此在脊柱融合［8-13］、創傷［14-16］和口腔［17］領域均應用良好。

1965 年Marshall Urist，M.D.詳細描述了骨誘導的過程［18］，而裸鼠異位成骨實驗已經被成功運用于證明骨誘導活性。我們旨在通過裸鼠異位植入試驗，研究本公司自主研發的脫礦骨纖維的骨誘導活性。

1 材料與儀器

主要材料：人類皮質骨

主要儀器：數控機床、骨鋸、骨鉆、精密恒溫培養箱、超聲清洗機、搖床、冷凍干燥機、切片機、光學顯微鏡等。

2 方法

2.1 材料制備

首先去除皮質骨上的軟組織，經初洗后，利用定制的專用工具制備骨纖維，利用鹽酸脫礦，脫礦后超聲清洗，最后經冷凍干燥后鋁箔封口包裝，γ 射線輻照滅菌備用。

2.2 實驗動物

6 只6～9 周的裸小鼠，在裸鼠腿部肌肉內植入脫礦骨纖維。

2.3 手術方法

使用異氟醚將動物麻醉，將麻醉后的動物以俯臥姿勢置于操作室潔凈操作臺上，并將其固定。用碘液在裸鼠背部、腰部區域進行擦拭，然后使用無菌紗布將碘液擦除。小心提起裸鼠背部腰處脊柱上方的皮膚，慢慢切開0.5 ～1 cm 長的切口。將皮膚切口小心撕開，然后使用鈍性器械剝離，在臀中肌組織中沿著平行于肌肉纖維的方向，打造出一個小袋狀空隙模型，注意操作過程避開血管。在空隙模型中植入實驗樣品，手術完畢后縫合肌肉皮膚。分別在植入2 周、4 周各處死三只后取材，進行標本大體觀察、肉眼觀察和組織切片觀察。

2.4 術后觀察

術后觀察裸鼠切口反應、活動、飲食情況以及有無炎癥。

2.5 組織形態學觀察

根據設計的不同時間段取材，取材后將標本放置于中性緩沖福爾馬林的組織盒中，福爾馬林組織液需完全浸沒標本，固定至少72 h，然后進行脫鈣、脫水、石蠟包埋并進行修整。另外，包埋前注意將樣本沿長軸對半切開，并將剖面朝下進行組織塊包埋。用組織切片機切成5 μm 厚切片，載玻片上展開并制作切片，進行HE 染色，最后用光學顯微鏡觀察。

3 結果與討論

3.1 術后觀察結果

試驗動物在觀察期間飲食、活動均正常，試驗動物傷口未見腫脹，未見膿性液體滲出。2 周、4 周取材時傷口愈合良好，植入材料被纖維結締組織緊密包裹，形成包塊，周圍肌肉未見水腫、壞死等不良反應。

3.2 組織學切片觀察結果

組織學觀察到術后2 周（圖1A、圖1B）植入物被少量纖維組織包繞，大量成纖維細胞及間充質細胞聚集，炎癥細胞少見，有新生血管形成（白箭頭），可見新生軟骨（黃箭頭）樣骨化。4 周（圖1C、圖1D）時，組織塊被薄層結締組織包繞，炎癥細胞少見，新生血管（白箭頭）組織豐富，可見多個新骨形成區?？捎^察到，新骨已成熟，膜內成骨活躍，骨髓豐富（脂肪、血細胞、漿細胞）；骨髓腔壁上排列整齊的成骨細胞，也有軟骨（黃箭頭）形成。軟骨成骨位于纖維內或纖維間，周圍有大量趨化聚集的間充質細胞及新生血管。

圖1 脫礦骨纖維復水前和復水后Fig.1 Images of demineralized bone fibers before and after rehydration

3.3 討論

一個理想的骨修復材料必須具備三個關鍵因素：細胞、支架和生長因子，它們分別起到骨形成、骨傳導和骨誘導的作用。該種脫礦骨纖維經精確控制脫礦，暴露骨材料中被無機成份遮蓋的骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP），具有適宜的鈣含量有利于新骨形成過程中的鈣鹽沉積。因特殊工藝使骨纖維是沿皮質長骨的徑向剝脫而成，因此每根骨纖維都含有數個完整及非完整的哈氏系統（50 μm）結構，便于植入后宿主間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）的侵入及毛細血管的長入，為骨傳導創造了良好的微環境。該產品是由純皮質骨制成，其膠原蛋白密度、非膠原蛋白密度均高于松質骨，因此比由松質骨制成的脫礦骨粉具有更好的骨誘導性能。另外，脫礦骨纖維的細長結構，可吸附更多定向成骨前體細胞及MSC 的吸附、增殖和分化，短時間內（8～12 周）在植入骨的整個區域內大量成骨。因此相比松質骨約24 周的取代過程，更易早期形成骨摻入，達到骨愈合。當骨纖維植入裸鼠肌肉內，骨纖維內暴露的BMPs 與未分化的MSC 表面受體結合，使MSC 在結構和功能上發生改變，首先分化成為成骨細胞前體細胞，然后前體細胞再分化成為成熟的骨細胞，再通過軟骨成骨和膜內成骨兩種方式形成新骨。本實驗中制備的脫礦骨纖維樣品植入裸鼠4 周就可以發現有新骨形成，有力證實了該骨纖維具有明顯的骨誘導活性。

4 結語

目前具備骨傳導的材料眾多，比如磷酸三鈣、生物玻璃等。但具備骨誘導的材料很少。脫礦骨纖維不僅具有明顯的誘導成骨能力，而且還具備特有的自然卷曲及相互纏繞作用，復水后可任意塑形，操作方便。目前在美國已經成為DBM 應用的主要形態, 但國內尚無此產品。作者認為該產品有望成為一種理想的骨科修復填充材料，亦會繼續跟進研究。