化學分散劑對深圳大鵬灣海水石油降解及細菌群落結構的影響

顏辰瑤，彭 超，吳一超，李 順，劉 丹，錢永明，路 璐

（西華師范大學1.生命科學學院/2.環境科學與工程學院，四川 南充 637009；3.中國科學院城市環境研究所，福建 廈門 361021）

化學分散劑可以降低石油在海面上的累積及遷移速度，減少大片油污遷移至海岸帶的機率[1]。其中，美國環境保護署核準的化學分散劑Corexit是目前國際上應對海洋石油污染常用的分散劑之一。然而，化學分散劑作為一種有機混合液，對海洋環境也存在潛在危害。已有研究表明，Corexit 對浮游植物[2]、海洋動物[3]及微生物[4]可產生毒性。微生物降解石油則是更為清潔高效的溢油清除途徑，也被認為是徹底消除海洋溢油的唯一途徑[5]。在墨西哥灣溢油事件中，超過50%的溢油是通過微生物降解途徑移除[6]。然而在海洋原位環境中，石油組分疏水性強、生物利用性低等特點成為限制微生物降解污染溢油效率的主要因素[7]。加入化學分散劑大大提高了石油在海水中的溶解度和生物可利用性，大量前期研究也證實投加分散劑可顯著促進石油的微生物降解過程[8-11]。但是，很多研究也發現化學分散劑對石油微生物降解存在抑制作用[12,13]。因此，化學分散劑對石油降解微生物的影響效應在國際學術界一直頗具爭議[14]。在我國，投加化學分散劑對石油降解微生物及其降解過程的效應研究尚處于起步階段?；瘜W分散劑如何影響海洋微生物的群落組成及主導石油降解菌群仍知之甚少[15]。

大鵬灣位于深圳市東南部，港口集裝箱運輸產業和航運業發達，是溢油事件發生的高風險區域。本研究以深圳大鵬灣為例，旨在揭示Corexit對海水中細菌群落結構、石油降解菌相對豐度及石油降解速率的影響，為評估分散劑的施用效果及其對環境微生物生態的影響提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本研究的海水樣品采自于深圳市東南部大鵬灣（22°33′20″N，114°21′41″E）。樣品使用卡蓋式采水器采集深度0～2 m 的表層海水60 L，置于冷藏箱中，溫度保持在4～6 ℃，24 h 內開展室內培養實驗。海水的pH 為7.90±0.02，溶解有機碳為（6.40±0.05）mg/L，溶解氧為9.11 μmol/L，鹽度為32±1。

1.2 主要儀器與試劑

旋轉蒸發儀（RV10，IKA，德國），氣相色譜-質譜聯用儀GC-MS（7890A-240MS，Agilent,美國），烷烴標準品（C7-C40）和16種多環芳烴（PAHs，Polycyclic Aromatic Hydrocarbons）標準品購自Sigma-Aldrich公司，系列濃度用色譜純正己烷配置。原油產自渤海灣的綏中原油，密度為0.962 g/mL。

1.3 室內模擬海水石油污染實驗的設置

1.3.1 污染物儲備液的制備 實驗設置3 個實驗組和1 個對照組，分別為石油可溶性組分（Water accommodated fraction，WAF）、石油和化學分散劑Corexit 混合物可溶性組分（Chemically enhanced water-accommodated fraction，CEWAF）、化學分散劑（Dispersant-only）及生物對照組（Biotic）。WAF、CEWAF 和Dispersant-only 的制備參考Kleindienst等[12]方法。步驟：1）用0.22 μm的濾膜過濾新鮮海水，將濾液置于65 ℃水浴鍋中進行巴氏滅菌2～3 h，重復3次，獲得滅菌海水。2）WAF：將850 mL滅菌海水置于1 L 玻璃瓶中，再加入150 mL 石油。CEWAF：向850 mL 滅菌海水中先加入150 mL 石油，再加入15 mL 的Corexit。Dispersant-only：取850 mL 滅菌海水，向其加入15 mL 的Corexit。3 個處理組以恒定轉速（500 r/min）避光磁力攪拌48 h后，置于分液漏斗中靜置，直至油水兩相分離。將下層液相收集至玻璃瓶中，即分別獲得WAF、CEWAF和Dispersant-only的儲備液。

1.3.2 培養實驗設置 將新鮮海水分裝于1 L 無菌玻璃瓶中，每瓶750 mL；向玻璃瓶中分別加入WAF、CEWAF 和Dispersant-only 儲備液，每個處理組設置3 個重復。Ziervogel 等[16]研究表明，當石油污染發生時，表層水體中的可溶有機碳（Dissolved Organic Carbon，DOC）在前21 d平均增加2倍，即約增加200～300 μmol/L。因此，為模擬海洋表層海水的石油污染，在各實驗組中分別加入相當于300 μmol/L DOC 的石油/分散劑污染物，Biotic 處理組為相應體積的滅菌海水。樣品瓶在25 ℃，轉速50 r/min 恒溫搖床中培養，培養過程中定時每隔3 d 開瓶通氣，保證培養瓶中有氧環境。分別在0、3、7和21 d四個時間點取樣。每個樣品瓶中250 mL 海水用于測定石油烴組分總烷烴和總多環芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs）；400 mL 海水過濾于0.22 μm 微孔濾膜（Millipore,USA）上，用于總微生物DNA提取。

1.4 烷烴和PAHs的萃取和分析

對于待測石油組分的樣品，向250 mL海水中加入15 mL二氯甲烷液液萃取，震蕩10 min，靜止10 min，收集有機相，并重復3 次；向萃取液中加入1 g 無水硫酸鈉去除水分，在旋轉蒸發儀上濃縮至2 mL，濃縮液經硅鎂吸附柱純化后，濃縮并定容至1 mL待測。

石油烷烴和PAHs 組分采用外標法在GC-MS上定量測定。標準品烷烴（C7-C40）和PAHs（16種）做標準曲線，用色譜純正己烷配置梯度濃度為1、5、10、20、30、40、50、100 μg/mL，各化合物的相關性均在0.998 以上。載氣（He）流速1 mL/min；不分流進樣。色譜柱為DB-5 石英毛細柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；進樣口溫度：250 ℃?？偼闊N測定升溫程序為：初始溫度35 ℃，以10 ℃/min溫度升溫至250 ℃保持2 min，以20 ℃/min 升至320 ℃，保持23 min。PAHs測定升溫程序為：80 ℃保持2 min，以80 ℃/min溫度升至180 ℃保持5 min，以4 ℃/min 升到290 ℃保持5 min。石油組分判定根據不同碳數烷烴和不同PAHs 的保留時間進行檢索，并同時與標準物比對進行定性。

1.5 總烷烴和總PAHs降解率的計算

不同處理組中的總烷烴和總PAHs 隨時間的降解率計算公式：

Y：不同培養時間點上海洋樣品中總烷烴和總PAHs的降解率（%）；ρt：培養td 后樣品中總烷烴和總PAHs 的質量濃度（μg/L）；ρ0：0 h 時樣品中總烷烴和總PAHs的質量濃度（μg/L）。

1.6 海水樣品微生物群落的分析

1.6.1 微生物總DNA 提取 將濾膜在無菌環境下剪切為碎片，采用FastDNA? Spin Kit for Soil (MP Biomedicals company)試劑盒提取海水總DNA。DNA 濃度和質量在NanoDrop 分光光度計（Nano‐drop Technologies Inc.,德國）上測定和評估，OD260/OD280在1.8～2.0 之間，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質量，主條帶明亮，無彌散現象，提取的DNA保存于-20 ℃以備后續分析。

1.6.2 Ilumina Miseq 測序分析及實時熒光定量PCR分析 高通量測序分析采用barcode 序列等修飾后的細菌通用引物515F和907R，擴增微生物V4-V5區的16S rRNA基因進行擴增[17]，50 μL PCR體系包括：25 μL 2XPCRMaster Mix，前、后引物各5 μL，2 μL DNA 模板，剩余用無菌水補齊。PCR 反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃復性45 s，72 ℃延伸1 min，37 個循環，最后72 ℃延伸8 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，純化后的PCR 產物等摩爾數混合，在Illumina Miseq平臺測序。序列上傳至NCBI數據庫，序列號為PRJNA810723。

實時熒光定量PCR (qPCR)擴增使用在寶生物工程（大連）有限公司的SYBR? Premix EX TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒，在CFX96 Optical Real-Time PCR System (Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)熒光定量儀上進行分析。qPCR 的標準曲線采用向載體質粒中導入含有細菌16S rRNA 基因的克隆子制備，將含有目標基因的克隆子在液體培養基中培養過夜，使用MiniBEST Plasmid Purification Kit（Takara）試劑盒進行質粒提取和純化，使用NanoDrop 2000 分光光度計測定DNA 的濃度結合其分子質量計算標線的原始拷貝數。對質粒標線按10 倍梯度稀釋，得到7 個數量級的標準曲線。定量PCR 的反應體系為20 μL，包括10 μL SYBR?Premix EX TaqTM（Tli RNaseH Plus），1 μL DNA模板，正向、反向引物分別為0.1 μl(10 μmol·L-1)和7.8 μL的滅菌雙蒸水。陰性對照采用滅菌雙蒸水代替樣品DNA。

1.7 統計分析

所有數據分析采用Excel 2010 和SPSS 27.0 進行處理分析，處理之間的平均值差異采用one-way ANOVA 單因素方差分析，顯著性水平α=0.05 表示差異，Origin 2018 作微生物群落結構組成圖，cytoscape作網絡分析圖。

2 結果

2.1 化學分散劑Corexit對海水中烷烴和PAHs降解率的影響

圖1 可知，添加Corexit 對總烷烴和總PAHs 降解的影響有所差異。對總烷烴的降解分析發現，培養3 d，添加Corexit 沒有顯著提高總烷烴的降解率（P>0.05）；培養7 d 時，WAF 處理組中總烷烴的降解率顯著高于CEWAF處理組（P<0.05）。培養21 d時，CEWAF 處理組的總烷烴降解率顯著高于WAF處理組（P<0.05），CEWAF 處理組的烷烴降解率（57.3%±0.06%）比WAF 處理組（42.8%±0.04%）高1.34 倍，添加Corexit顯示出促進作用。對PAHs降解的數據分析表明，在培養的前7 d，WAF和CEWAF處理組的PAHs降解率無顯著差異（P>0.05）；培養21 d時，CEWAF 處理組中總PAHs 的降解率（48.5%±0.02%）才顯著高于WAF 處理組（39.8%±0.02%）（P<0.05），是WAF處理組降解率的1.22倍，表明添加Corexit在培養后期促進了總PAHs的降解。

圖1 WAF和CEWAF處理組中降解率隨時間的變化Fig.1 Degradation rates of in WAF and CEWAF treatments across the incubation time

2.2 細菌16S rRNA基因拷貝數分析

從圖2 看出，與Biotic 比較，在WAF 處理組中，從3 d 至21 d，其微生物拷貝數都顯著高于對照組，且在7 d 時豐度最高。CEWAF 處理組在不同培養時間點，微生物豐度均顯著高于WAF 處理組（P<0.05）。在僅添加分散劑的處理組中微生物豐度與0 h時相比也顯著增加。

圖2 細菌16S rRNA基因拷貝數Fig.2 Copy numbers of bacterial 16S rRNA genes

2.3 化學分散劑Corexit 對海水中細菌群落結構的影響

16S rRNA 基因Miseq 高通量測序結果揭示不同處理組中細菌群落結構的變化（圖3）。與Biotic處理組相比，WAF、CEWAF、Dispersant-Only 三個處理組中，主導細菌菌群發生了改變，不同實驗組中細菌群落結構顯著差異（P<0.01），且不同培養時間菌群結構有所差異。添加WAF 促進了海水原位石油降解菌的增加，培養3 d 時，Neptuniibacter、Aestuariibacter、Lutimaribacter、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Aquibacter（水桿菌屬）和Planctomyces的相對豐度相比于WAF 處理組的0 h 時增加388、34.3、11.0、7.6、5.7 和4.7 倍。其中，Lutimaribacter增加的相對豐度最高，增加了10.47%。培養7 d 時，WAF 處理組中主導菌群為Lutimaribacter（31.3%）、Acinetobacter（24.3%），占總菌群群落的55.6%。而培養21 d 時，主導菌群變為Planctomyces（35.4%），此外，相比于0 h，Haliea和Winogradskyella也有顯著增加，分別增加了28.2和21.6倍。

圖3 不同處理組中屬水平的細菌群落結構隨培養時間的變化情況Fig.3 Changes in the bacterial community structure at the genus level across the incubation time in different treatments

添加分散劑的CEWAF 處理組的主導菌群組成與WAF 處理組不同，表明添加分散劑Corexit 改變了石油降解菌群。CEWAF 處理組3 d 時，Neptunii‐bacter（36.3%）和Alteromonas（10.6%）為主導菌群，相對豐度相比于0 h 增加了36 636 和13.4 倍。其中，Neptuniibacter的相對豐度比WAF 處理組3 d 時高91.2 倍。而在培養7 和21 d 后，主導菌群均為Planctomyces，相對豐度分別達到40.1%和26.0%，相比于0 h 增加了294.3 和190.3 倍。其中，7 d 時，Planctomyces在CEWAF 處理組中相對豐度比WAF處理中高出37.4%，是WAF 處理中的13.5 倍。CEWAF 處理中Haliea和Pseudomona增加的相對豐度也高于WAF處理組。在僅添加Corexit的dispersantonly 處理組中，培養3 d，主導菌群為Alteromonas（41.9%）、Neptuniibacter（16.8%），Aestuariibacter（14.6%），其中Alteromonas和Aestuariibacter的豐度比CEWAF處理組3 d時高3.0和7.5倍。在dispersantonly處理組培養7和21 d 時，Lutimaribacter、Oleiphilus、Haliea、Pseudomonas等菌都有顯著富集。21 d 時，Dispersant-only 處理組中主導菌群為Lutimaribacter（21.5%）、Polycyclovorans（16.8%）和Pseudomonas（9.4%），其中Polycyclovorans相比于0 h增加16 848 倍，且比WAF 處理組21 d 時Polycyclov‐orans的相對豐度高28.2倍。

2.4 海水菌群相關性網絡關聯分析

基于不同處理組以及不同時間點的細菌群落OTU 組成，分析所有樣品中OTU 相對豐度變化的相關性，將顯著相關(P<0.01)的OTU呈現于網絡圖中（圖4）。此網絡顯示有強相關性的OTU 有273個，它們之間存在586 種聯系。網絡互作關系中負相關的連線占比為53.1%，正相關比例為46.9%。通過對不同微生物類群節點數量進行統計，發現此網絡中α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）的節點數最多，占總節點數的24.1%和23.9%，其次是黃桿菌綱（Flavobacteriia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）和浮霉菌綱（Planctomycetota），比例分別為9.3%、6.6%和4.4%；網絡中連通度相對較高的關鍵OTU 有13 個（表1）。其中有石油降解菌Thalassotalea、Planctomyces、Oleibacter 等。Planctomyces 在不同處理組中都隨時間顯著富集，為海洋中常見石油降解菌[18]。

表1 基于OTU的細菌群落網絡分析中的關鍵OTUsTable 1 The key OTUs of the bacterial network based on the microbial OTU composition

圖4 基于不同處理組中的細菌群落OTU組成的分子生態網絡分析Fig.4 Network analysis depicting the co-occurrence pattern among the OTU compositions of bacterial communities for different treatments

3 討論

3.1 分散劑Corexit對石油不同組分的降解率影響

加入分散劑的CEWAF 處理組中，Corexit 顯著提高了石油組分的降解率，這一結果與在墨西哥灣[8]、挪威海峽[19]及北冰洋[20]等海域的研究結果一致。然而，在該培養實驗前7 d，Corexit 對總烷烴和總PAHs 的降解并未有促進作用，甚至3 d 時對總烷烴的降解呈抑制作用，該現象在對美國基普拉德霍灣的海水研究中也有發現，Foght等[21]在對美國基普拉德霍灣的海水研究發現Corexit 成分中的磺基琥珀酸鈉二辛酯能抑制烷烴的微生物降解。純菌水平也發現Corexit 中的表面活性劑成分（如Span 20、Tween 80 和Tween85 等）能顯著抑制Acinetobacter calcoaceticus和Rhodococcussp.str.094 降解烷烴的能力[22]。此外，在該實驗培養初期，Corexit 未促進石油組分降解還可能是由于Corexit 本身優先于石油被微生物所降解，間接對石油降解過程產生影響。Lindstrom 等[23]研究發現海洋微生物群落降解Corexit 的速率顯著高于降解原油的速率，同時Corexit 的加入可能促使海洋微生物選擇性地降解特定碳氫化合物。也有研究發現很多有機物降解微生物能同時降解石油和分散劑[24-25]，最終也促進石油組分降解。此外，在WAF 處理組培養初期，總烷烴的降解率高于總PAHs 的降解率，這與海水中石油降解微生物有選擇性地降解不同碳氫化合物有關。石油降解微生物菌群會偏好性地優先降解直鏈烷烴及低分子質量碳氫化合物（C2-C5），隨后對PAHs 及高分子質量碳氫化合物（C5-C20）等進行降解[26]。綜上，在深圳大鵬灣海水中，投加Corexit 能促進石油組分的降解，且在不同時間尺度上對石油不同組分的降解率影響也有差異。

3.2 深圳大鵬灣海水中的石油降解菌群落結構

石油進入海洋，海洋環境中的石油降解微生物能迅速通過提高代謝速率和繁殖速度來分解石油組分[27]。石油組分的添加顯著促進海水中石油降解菌增加，主導的石油降解菌隨著培養時間變化顯著。在WAF處理組中，培養3 d時，多種石油降解菌相對豐度增加3.39～388 倍，其中，Neptuniibater[28]、Pseudomonas[29]、Aquibacter[30]等都為海水中常見的石油烴降解菌。7d時的主導石油降解菌為Lu‐timaribacter和Acinetobacter，在波斯灣溢油污染后，發現Lutimaribacter顯著增加，為海水中天然石油降解菌[31]。Acinetobacter的不同菌屬能高效降解烷烴和多環芳烴[32-33]，在渤海灣的石油污染水域也有大量富集[34]。Lutimaribacter和Acinetobacter在培養中期顯著富集，也與該時刻總烷烴和總PAHs 的高降解率相耦合。WAF 處理組培養后期，Planctomy‐ces成為主導石油降解菌，該菌在深海石油泄漏區域的海水也被發現有顯著富集[35]。同時，該菌在海洋溢油的PAHs降解中有很多報道，在墨西哥灣及Exxon Valdez 溢油海域，均發現其參與PAHs 的降解[36]，說明該菌為降解海水中持久性的石油組分有貢獻。

此外，綜合分析石油烴降解率和細菌群落變化的數據發現，雖然石油烴的降解主要發生在前7 d，但培養21 d時，海水中的主導石油降解菌卻與前7 d的菌群有差異顯著。該現象可能與隨著培養時間推進，海水中營養成分（如氮和磷）被迅速消耗，造成微生物豐度減少和石油降解效率降低有關[12]；其次，培養后期選擇出的石油降解菌，如Planctomyces，可能參與了降解高分子量的石油烴或降解醇類等石油降解中間產物[37]。

3.3 投加分散劑Corexit 改變海水原位石油降解菌群落結構

分散劑作為外源有機物，對海水中微生物群落結構會產生影響[15]。本研究CEWAF 處理組中，石油降解菌菌群變化與WAF 處理組有顯著差異，Kleindienst 等[12]、Stephen 等[8]對墨西哥灣海水中微生物對Corexit 的響應研究發現，Corexit 促進了能同時降解分散劑和石油的碳氫化合物降解菌Colwellia的生長，而抑制原位天然石油降解菌Marinobacter的生長，進而影響石油烴的降解規律。值得注意的是，WAF 和CEWAF 處理組中的微生物群落結構雖然有顯著差異，但是在培養21 d 時，CEWAF處理組中石油烴降解率才顯著高于WAF處理組。該結果可能由于CEWAF 組增溶的石油烴組分促進了微生物的生長（圖1），也促進了多樣性更高和降解效率各異的石油降解菌群，進而提高CEWAF 處理組中降解率[27]。其次，CEWAF 處理組中的一些石油降解菌也可能同時參與分散劑降解，進而影響培養初期石油烴的降解效率[12]。

在添加Corexit 后，主導的石油降解菌由WAF中的Lutimaribacter、Acinetobacter，Planctomyces變為Neptuniibacter、Planctomyces、Alteromonas。培養的第3 d，CEWAF相比于WAF處理組Neptuniibacter顯著富集，抑制了Lutimaribacter的生長。Doyle等[38]在美國加爾維斯頓港附近海水中也發現在同時加入石油和Corexit 的處理組中，Neptuniibacter在海水微生物群落中的相對豐度顯著升高。在Dispersant-only 處理組中，Neptuniibacter也有富集，表明該菌可能同時參與了石油和分散劑的降解。在培養7 d 和21 d 后，CEWAF 的主導菌均為Planctomyces，在僅加入分散劑的Dispersant-only 處理組中Planctomyces相比于0 h 也富集了294.3 和190.3 倍。Planctomyces作為海洋中常見的石油降解菌[18]，在Couto 等[39]對巴西格米亞海灘附近海水的研究中發現，石油污染時，加入分散劑促進了Planctomyces生長，表明Planctomyces可能同時參與石油和分散劑降解。該菌在網絡分析中為關鍵菌屬，與菌群中多種微生物互作關系緊密，在不同處理組中，可能均參與多種有機物降解。此外，CEWAF 處理組中，加入Corexit 促進了Haliea和Pseudomonas等石油降解微生物的富集，這些菌在海洋石油的微生物降解過程中都起重要作用[40]。

相比于WAF 處理組，CEWAF 處理組中細菌群落結構的顯著變化可能有如下幾個原因：1）某些石油降解菌因為其自身親水親油性，易吸附在油/水界面上，Corexit 的加入乳化浮油形成油滴溶于水，為這些菌提供更多吸附界面，定向促進一些石油降解菌生長。如海洋中隸屬于Alteromonaldaceae的菌群更易聚集于各種界面環境（海水表面、可溶性顆粒物等）[41]。2）CEWAF 處理組中，由于加入分散劑，促進石油中不可溶組分的水溶性，雖然本實驗中WAF 和CEWAF 處理組中加入同等量的DOC，但其中的石油組分組成不同[12]。溢油污染發生后，海水中石油降解菌的菌群結構的變化很大程度上取決于石油組分的組成[28]。3）分散劑可能對某些微生物有較強毒性，或可作為一些微生物的底物進行降解行為，進而導致微生物豐度增加和細菌群落結構的變化。如Campo 等[42]研究發現從海水中分離的兩株石油降解菌可高效降解Corexit。在Dispersant-only 處理組中，石油降解菌Alteromonas、Neptuniibacter、Pseudomonas等均顯著富集，表明這些菌可能參與Corexit 的降解。

4 結論

化學分散劑對海洋溢油降解過程和海洋細菌群落的影響隨分散劑類型、石油種類及環境條件的不同而有所差異。因此，研究不同海域分散劑對石油降解及微生物的影響能為分散劑的選擇和使用提供依據。本研究發現：1）加入Corexit促進海水中微生物的生長，培養21 d 時促進了石油降解效率；2）加入石油和Corexit 改變了海水原位的石油降解微生物菌群，由主導的石油降解Lutimaribacter、Acinetobacter和Planctomyces轉變為Neptuniibacter、Planctomyces和Alteromonas；（3）在僅加入Corexit的處理中，Alteromonas和Lutimaribacter的富集表明了其可能同時具有降解石油和分散劑的能力?；诒狙芯?，未來可針對不同海域進一步開展化學分散劑對海洋微生物石油降解效率和代謝機制的研究，為海洋溢油事故中化學分散劑的使用提供指導依據。