含五種RNA病毒核酸假病毒的制備及特性研究

程巧珍,陳 春,應 婷,伍義行,葉子弘,廖學俊,胡華軍

(中國計量大學 生命科學學院 浙江省生物計量與檢驗檢疫技術重點實驗室,浙江 杭州 310018)

隨著國內外細胞治療技術的迅速發展,細胞治療在癌癥、血液病、心血管病、糖尿病等治療上顯現出越來越高的應用價值[1]。細胞治療主要包括腫瘤細胞免疫治療和干細胞治療,細胞制劑是細胞治療中的重要制劑,所以在生產管理和質量控制上需要嚴格要求。這不僅順應了國際上細胞制劑標準化制備和應用的主流趨勢,也直接影響到細胞治療的安全性和有效性。另外細胞制劑中內外致病因子的污染是影響細胞制劑生產管理和質量控制中關鍵因素之一。其中RNA病毒是影響人類健康的重要病原體,在世界范圍內可引起致命性疾病的散發、流行或大流行。RNA病毒中HCV、HIV-1/2、HTLV-1/2在世界范圍內流行,并具有相似的傳播方式,還存在很多合并感染,已被世界衛生組織國際癌癥研究機構列入致癌物清單中[2-3]。同時國內細胞制劑相關的標準,如《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則(試行)》(2015國家衛生和計劃生育委員會辦公廳和國家食品藥品監督管理總局)、《免疫細胞制劑制備質量管理自律規范》(2016中國醫藥生物技術協會)、《干細胞制劑制備質量管理自律規范》(2016中國醫藥生物技術協會)、《干細胞通用要求》(2017國家標準委)、《CAR-T細胞制劑制備質量管理規范》(2018中國醫藥生物技術協會)團體標準征求意見稿等都規定,對細胞制劑中的RNA病毒包括但不限于HIV、HTLV、HCV病毒明確要求檢測。

由于細胞制劑來源于供體的細胞培養物,經初檢合格的供體細胞經歷了多代的分離、純化和培養過程,同時有些供體細胞可能存在整合前病毒或者漏檢,其細胞內的RNA病毒復制量可能隨宿主細胞的狀態而改變,導致細胞制劑中RNA病毒的抗原和抗體都很難檢測。而細胞制劑中RNA病毒的核酸檢測方法敏感性高,特異性高,“窗口期”漏檢率低已成為重要的質控內容。目前針對RNA病毒包括HCV、HIV-1/2、HTLV-1/2病毒有多種核酸檢測方法,如熒光定量PCR法、轉錄介導的擴增系統(TMA)法和核酸序列依賴擴增系統(NASBA)法,以及bDNA技術和數字PCR技術等[4-8]。為了更準確地評價核酸檢測結果的可靠性,設立核酸定性定量檢測的質控品成為不可或缺的一部分。一方面,針對這些RNA病毒核酸檢測的陽性質控品常使用臨床樣本中的活病毒、滅活病毒及裸露的RNA,它們存在有生物安全隱患、滅活不徹底、成本高、提純難、穩定性差等缺陷。近年來應用的噬菌體裝甲RNA則基本克服了上述缺陷,隨著穩定性、安全性和準確性的提高,已經廣泛應用于RNA病毒檢測質控品[9]。由于目前大多數質控品都基本只針對某一種RNA病毒,很少同時作為多種RNA病毒檢測的核酸標準品。對此，本研究的目的是制備一種裝載HCV、HIV-1/2、HTLV-1/2這五種RNA病毒核酸片段的假病毒,以作為細胞制劑中上述五種RNA病毒核酸檢測的陽性質控品。

1 材料方法

1.1 菌株、質粒

大腸桿菌Trans5α和E.coliBL21(DE3)感受態購自北京全式金生物技術有限公司,pACY-CDuet-1質粒(Trans5α)購自北京華越洋生物科技有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒和SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(一同購自上海生工),RNA/DNA Extraction Kit試劑盒,和逆轉錄試劑盒(均購自北京寶日醫生物技術有限公司),核酸內切酶為KpnI和PacI,BamHI和NotI(購于杭州自創試生物科技有限公司),氯霉素(購自北京索萊寶科技有限公司);ZHWY-100B恒溫培養振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司),EPS300電泳儀和Tanon-1600凝膠成像系統(上海天能科技有限公司),16K-R高速冷凍離心機(長沙市鑫奧儀器儀表有限公司),XP基因擴增儀器(杭州博日科技有限公司),H7650透射電子顯微鏡(TEM)(日本日立公司)。

1.3 基因序列合成

參考GenBank中MS2噬菌體(NC_001417.2)、HCV(D11168.1)、HIV-1(MG760423.1)、HIV-2(MH681607.1)、HTLV-1(LC210065)及HTLV-2(AF074965.1)進行MS2噬菌體與五種RNA病毒保守序列串聯核酸片段的設計,并分別在五種RNA病毒保守序列串聯基因5′端加上KpnI酶切位點及MS2的由19個堿基構成的包裝位點(C-variant pac sites),3′端加上PacI酶切位點及C-variant pac sites;在MS2基因5′端加上BamHI酶切位點,3′端加上NotI酶切位點,都由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,并提供兩種包含目的片段的PUC-SP質粒,命名為PUC-SP-5Virus和PUC-SP-MS2質粒。MS2片段(1 660 bp)的通用引物pACYCDuetUP1和DuetDOWN1以及5Virus保守基因串聯片段(1 458 bp)(序列信息如圖1)的引物DuetUP2和T7t由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

圖1 五種病毒保守基因串聯片段的序列信息

1.4 pACYCDuet-1-MS2-5Virus質粒的構建

對PUC-SP-MS2質粒和pACYCDuet-1載體采用BamHI和NotI雙酶切,常規電泳,割膠回收后,將MS2目的片段和線性載體pACYCDuet-1進行連接。再將連接產物轉化感受態細胞Trans5a,涂板挑單菌落培養擴增,提質粒并利用引物pACYCDuetUP1和DuetDOWN1進行PCR擴增驗證,鑒定為陽性中間質粒命名為pACYCDuet-1-MS2。

然后對pACYCDuet-1-MS2中間質粒和PUC-SP-5Virus質粒分別同時用KpnI和PacI雙酶切,常規電泳,割膠回收5Virus目的片段和線性載體pACYCDuet-1-MS2進行連接,將連接產物轉化感受態細胞Trans5a,涂板挑單菌落培養擴增,提質粒并進行PCR及測序鑒定。PCR鑒定分別對MS2和5Virus兩個目的片段驗證,最終鑒定為陽性重組質粒命名為pACYCDuet-1-MS2-5Virus。

1.5 pACYCDuet-1-MS2-5Virus質粒轉化菌的誘導表達及純化及SDS-PAGE分析

將重組質粒pACYCDuet-1-MS2-5Virus轉化到感受態細胞E.coliBL21(DE3)中,并涂布含有25 mg/mL氯霉素的瓊脂平板上,挑單菌落過夜活化作為母液。從母液取出1 mL按1∶100的比例接種到100 mL的LB培養基中220 r/min 37 ℃培養至菌液OD600 nm值達到0.6 h,加入物質的量濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導培養6 h,12 000 r/min離心5 min去上清,收集菌體沉淀,細菌裂解液重懸菌體37 ℃水浴30 min,再于4 ℃下超聲波破碎,條件為400 W超聲5 s間歇10 s,總共超聲作用5 min待菌液透明后,10 000 r/min 4 ℃離心10 min收集上清液轉移到超濾離心管(Millipore Ultra-15 10 kD)中4 000 r/min離心1 h純化濃縮。

再分別取IPTG誘導后重組菌液和未經誘導的菌液即對照組各1 mL,12 000 r/min離心1 min收集菌體沉淀。加入30 μL PBS緩沖液溶解,加入等體積的蛋白上樣緩沖液混勻,煮沸6 min,離心各取上清液10 μL上樣,進行SDS-PAGE電泳分析。同時,另取純化濃縮好的5V 10 μL在同條件下處理分析。

1.6 電鏡檢測

取濃縮的5V 20 μL在電鏡觀察。

1.7 5V DNase I、RNase A抗性鑒定及保存期試驗

1.7.1 5V的DNase I處理及鑒定

將濃縮后的5V稀釋1 000倍,分為6組,其中3組加入終濃度分別達到100 U/mL脫氧核糖核酸酶,另外3組加入終濃度為50 U/mL脫氧核糖核酸酶(DNase I),37 ℃處理1 h,加入終止液65 ℃作用15 min,之后將每一組分成2份,1份用RNA/DNA提取試劑盒抽提RNA/DNA,再去除DNA之后進行RT-PCR擴增。另一份不經反轉錄直接PCR擴增。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.7.2 5V的核糖核酸酶抗性試驗

取100倍稀釋度的5V樣本3組,每組兩份,分別加1 mg/mL核糖核酸酶(RNase A)其中1組加10 μL,另一組加20 μL,37 ℃水浴加熱25 min,同時設立不加RNaseA處理的對照組。將所有樣品進行RNA抽提并進行RT-PCR鑒定。

1.7.3 5V保存期試驗

取稀釋100倍的5V放置在-20 ℃冰箱6個月后,分別取出3管抽提RNA并進行RT-PCR鑒定。

2 結果

2.1 重組質粒pACYCDuet-1-MS2-5Virus質粒構建結果

如圖2所示,用引物DuetUP2/T7t和pA-CYCDuetUP1/DuetDOWN1對pACYCDuet-1-MS2-5Virus質粒進行PCR擴增,電泳結果顯示用引物DuetUP2/T7t擴增出條帶片段大小約為1 500 bp;用引物pACYCDuetUP1/DuetDOWN1擴增出條帶片段大小約為1 700 bp,兩種引物都擴增的條帶大小與目的片段相同,進一步測序結果正確。證明重組質粒pACYCDuet-1-MS2-5Virus質粒構建成功。

M—Marker;1—陽性對照(MS2目的片段);2—陽性對照(5Virus目的片段);3、4、5—pACYCDuet-1-MS2-5Virus PCR驗證MS2片段;6、7、8—pACYCDuet-1-MS2-5Virus PCR驗證五種RNA病毒片段;9—陰性對照圖2 pACYCDuet-1-MS2-Virus質粒PCR鑒定圖

2.2 pACYCDuet-1-MS2-5Virus/BL21(DE3)重組菌誘導表達及5V純化結果

如圖3所示,SDS-PAGE電泳顯示重組菌pACYCDuet-1-MS2-5Virus/BL21(DE3)誘導表達泳道出現了明顯的12 kD的目的蛋白帶,而對照菌體未出現目的條帶,表明重組菌獲得了有效表達;經超濾離心管濃縮純化的5V電泳泳道只出現了噬菌體單一衣殼蛋白單體的唯一條帶、大小約為12 kD,表明重組的5V獲得高效純化。電鏡下觀察到直徑約30 nm的5V,證明5V成功制備(圖4)。

M—Marker;1—BL21(DE3)空菌;2—未加誘導劑的PACYC-1-MS2-5Virus重組菌;3—加IPTG誘導的PACYC-1-MS2-5Virus重組菌;4—純化的5V圖3 SDS-PAGE電泳圖

圖4 5V電鏡圖40 000×Figure 4 Circular virus particles 40 000× of 5V

2.3 5V DNase I、RNase A抗性鑒定和保存期試驗結果

2.3.1 5V DNase I處理后的RT-PCR鑒定結果

M—Marker;1,9—陽性對照;2、4、6—5V稀釋1 000倍經過100 U/mL DNase I處理后進行RT-PCR;3、5、7—5V稀釋1 000倍經過100 U/mL DNase I處理后未經反轉錄直接進行PCR;8,10—陰性對照

M—Marker; 1—陽性對照;2、4、6—5V稀釋1 000倍經過50 U/mL DNase I處理后進行RT-PCR;3、5、7—5V稀釋1 000倍經過50 U/mL DNase I處理后未經反轉錄直接進行PCR;8—陰性對照圖5 5V 脫氧核糖核酸酶抗性結果圖

如圖5(a)(b)所示,瓊脂糖電泳檢測,結果進行RT-PCR的各組在1 500 bp擴增出明顯的目的條帶,而未經反轉錄直接PCR的對照組未見條帶。結果表明5V里確實包裹了五種RNA病毒基因的RNA序列,而且完全去除了5V摻雜的質粒DNA雜質的殘留。

2.3.2 5V RNase A處理后的RT-PCR鑒定結果

如圖6,將100倍稀釋的5V用1 mg/mL的RNase A 10 μL/20 μL處理后,提取RNA后進行RT-PCR實驗組和對照組在1 500 bp擴增出明顯的目的條帶。

M—Marker;1—陽性對照;2、3、4—5V稀釋100倍經過10 μL RNase A處理后RT-PCR;5、6、7—5V稀釋100倍經過20 μL RNase A處理后RT-PCR;8—陰性對照圖6 5V核糖核酸酶抗性結果圖

2.3.3 5V的保存期試驗

將5V稀釋100倍后分別放置-20 ℃冰箱6個月后進行RT-PCR鑒定,同時未進行反轉錄的5V樣品作為對照結果如圖7。

M—Marker;1—陽性對照;3、5、7—5V稀釋100倍在-20 ℃保存6個月后RT-PCR;2、4、6—5V稀釋100倍在-20 ℃保存6個月后直接PCR;8—陰性對照圖7 5V保存期試驗圖

3 討 論

近年來裝甲RNA技術已被廣泛應用于核酸檢測,該技術可以通過基因重組技術將病毒靶基因片段非特異性地包裝到噬菌體病毒衣殼內從而構建假病毒顆粒。假病毒不能自己復制,在實驗的過程中沒有致病性,有蛋白質外殼包裹具有耐核酸酶作用穩定性好,制備高效,可以對核酸檢測的全過程進行質控。據國內外研究報道,利用裝甲RNA技術已經成功構建了不同的RNA病毒的裝甲RNA質控品,包括丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)、諾如病毒(norovirus)、流感病毒(influenza virus)、寨卡病毒(zika virus)、輪狀病毒(rota virus)、風疹病毒(rubella Virus)以及人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus)、新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)等[10-16]。

理論上MS2噬菌體裝甲RNA最大的包裝片段為4 kbp[17],到目前為止報道到文獻中MS2裝甲RNA最大的外源RNA包裝長度為3 034 bp[13]。本研究制備的MS2裝甲RNA包裝的靶基因為HCV、HIV-1/2、HTLV-1/2這五種病毒保守基因序列的串聯長度約1 500 bp。選擇這些病毒保守序列主要依據目前通行的國際檢測標準、行業標準，以及國內外相關病毒檢測的文獻報道、檢測技術規范等[11,18-24]。另外根據這五種RNA病毒各自的不同地區的毒株基因全序列及多種亞型病毒基因全序列采用MEGA 3.0軟件進行比對分析后確定相應的保守基因序列,并在進行全物種BLAST比對驗證。本研究所制備的裝載五種RNA病毒核酸片段的假病毒5V,純度高,能抵抗高濃度的DNase I和RNase A的降解,具有良好的穩定性,而且-20 ℃條件下易于保存。假病毒5V不具備病毒的傳染性,具有良好的生物安全性。同時假病毒5V由于攜帶了五種RNA病毒(HCV、HIV-1/2、HTLV-1/2)的遺傳信息,可以同時作為這五種病毒的模擬物應用到對病毒核酸提取、反轉錄、擴增以及核酸定量整個過程的質量監測,滿足在細胞制劑的產品檢測中對核酸陽性質控品的基本要求。