尿源干細胞及其細胞外囊泡在再生醫學中的研究進展

徐依赟， 邱 雨， 吳氫凱

(上海交通大學附屬第六人民醫院婦產科,上海 200233)

尿源干細胞(urine-derived stem cells, USCs)是指從尿液中提取的具有良好擴增能力、多系分化潛能、旁分泌功能的一種新型多能干細胞[1]。干細胞根據其發育潛能分為全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞。根據干細胞發育階段又分為胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)和成體干細胞(adult stem cells, ASCs)。ESCs來源于胚泡的內部細胞團，能夠分化為三胚層組織，具有形成完整個體的潛能，屬于全能干細胞。ESCs因其倫理爭議和成瘤風險在臨床治療中受限制[2]。ASCs來源于已分化組織中的未分化細胞，能夠分化為單種或多種組織、器官，具有有限的自我更新能力和分化潛能，屬于多能干細胞或單能干細胞。ASCs包括間充質干細胞，造血干細胞，神經干細胞，血管內皮干細胞，肝干細胞，上皮干細胞等。根據USCs的來源和生物學性質，USCs屬于ASCs的一種類型。在再生醫學研究中，研究最多的是間充質干細胞(mesenchymal cells, MSCs)。目前，已經從許多不同組織中成功分離出MSCs，包括骨髓、脂肪、軟骨、骨骼肌、臍帶、胎盤等[3]。但大部分MSCs的獲得需要侵入性操作，并且存在潛在的并發癥，包括疼痛、感染、出血等。USCs可采用非侵入方法收集，具有獲取簡單、多次重復、來源豐富、無創無痛的優勢[4]。USCs作為一種自體來源的干細胞，具有穩定增殖和多向分化的能力，是組織工程修復潛在的種子細胞。USCs來源的細胞外囊泡(extracellular vesicles secreted by urine-derived stem cells, USCs-EVs)通過釋放生物活性物質發揮與USCs類似的生物學作用。作為一種無創獲取的干細胞及其衍生物，從尿中分離出來的USCs及EVs，有望成為再生醫學的新希望。

1 USCs的來源、分離、培養及生物學特征

1.1 USCs的來源

2008年，Zhang等[5]首次報道成功從人尿液中提取出具有干細胞特性的細胞。自此，打開了研究USCs的大門。Bharadwaj等[6]從接受男性腎臟移植的女性患者的尿液中分離及培養人USCs，隨后觀察到細胞中含有“Y”染色體，并且高表達腎臟特異性基因CD224、CD13、NR3C2、CD146、PAX2、PAX8，由此推測USCs可能起源于腎臟。

1.2 USCs的分離及培養

USCs具體的分離培養方法[7]如下: (1) 收集無菌中段尿液，加入抗生素防止污染，離心收集沉淀；(2) 磷酸鹽緩沖溶液洗滌沉淀兩次；(3) 沉淀物重懸于USCs培養基；(4) 將懸浮液接種到預先明膠包被的24孔板，放入5% CO2、37 ℃培養箱培養。約3～8 d，即有細胞克隆形成。此外，尿液離體后樣本保存時間和方式是至關重要的，與USCs的活性息息相關。新鮮的尿液樣本應儲存在4℃條件下，并且在盡量短的時間內分離USCs。Lang等[8]通過優化尿液離體后的保存技術，發現即使經過24 h的儲存和運輸，依舊可以保持USCs的細胞活力和細胞特性，例如在細胞形態、增殖方式、表面標志物表達、自我更新能力、分化能力、端粒酶活性、染色體穩定性等方面。與傳統干細胞的獲取方式相比，USCs的分離僅需簡單的離心，成本低廉，無需住院、活檢和手術等額外支出，是比較理想的自體干細胞來源[9]。

1.3 USCs的生物學特征

USCs呈短梭“米粒樣”外觀，生長曲線呈典型“S”形，有足夠的端粒酶長度和高端粒酶活性，具有高度的擴增能力、良好的分化能力且無成瘤風險。研究表明，USCs培養大約4周后，單個USC克隆可以獲得3.8×108個細胞，200 mL尿液樣本產生的平均細胞數可達到約5.0×109個[10]。由此推算，24 h的尿液收集即可獲得足夠數量的細胞，能夠滿足大多數患者臨床應用的需求。USCs經過數代培養后，染色體數目保持穩定，并且在裸鼠皮下移植后，無腫瘤或惡性組織形成[11]。USCs表達關鍵間充質干細胞標志物(CD44、CD73、CD90、CD105)，周細胞標志物(CD224、CD146)和多能干細胞標志物(OCT3/4, C-MYC, SOX2，SSEA-4)，不表達造血干細胞標志物(CD34、CD45)[9]。此外USCs還表達小部分內皮細胞標志物，平滑肌細胞標志物和間質細胞標志物。雖然USCs目前尚沒有特異性的標志物，但通過可靠、穩定的提取培養辦法，聯合多種USCs標志物，可以對其進行初步鑒定。USCs不僅具有成脂肪、成骨、成軟骨三系分化能力，還可以分化為其他細胞系，如尿路平滑肌細胞、尿路上皮細胞、神經細胞、內皮細胞等[12]。USCs的生長形態、表面標志物、高度增殖能力和三系分化潛能符合國際細胞療法協會(International Society for Cellular Therapy, ISCT)對MSCs的定義，因此USCs可能是MSCs的新成員。研究者發現來源于不同供體的USCs克隆進行分化時，表現出不同的分化能力。這說明人體尿液中存在不同分化階段，不同分化潛能的USCs，由此推測USCs應是一個干細胞群，而不是單一類型的細胞[13]。近年來，干細胞療法作為一種新的治療手段在再生醫學鄰域十分熱門。MSCs具有高度自我更新、多向分化潛能的特點，能夠分化成不同細胞系，促進相應受損器官、組織的再生與修復。但是，大多數MSCs移植治療仍存在來源操作有創性、倫理問題、致畸風險、免疫排斥等問題。USCs具有來源無限、安全無創、可自體取材等獨特的優點，在再生醫學領域具有廣闊的臨床應用前景。尿源干細胞及細胞外囊泡的應用見圖1。

圖1 尿源干細胞及其細胞外囊泡的應用Fig.1 The application of USCs and USCs-EVs

2 尿源干細胞在再生醫學中的應用

2.1 USCs在泌尿生殖系統疾病治療中的應用

USCs與泌尿生殖道組織在胚胎發育期間具有同源性，非常適用于泌尿、生殖系統疾病的治療。

2.1.1 USCs在腎臟疾病中的應用 腎臟疾病發病原因復雜，發病率高。目前臨床多采用腎臟替代療法，如透析或移植。但是透析只能夠延緩疾病發展和延長患者生存周期，而腎臟移植更是面臨腎源少、費用高的難題。近年來，研究者們發現干細胞療法為腎組織再生修復提供了新的選擇[14]。與脂肪來源的干細胞(adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)和羊水來源的干細胞(amniotic fluid-derived stem cells, AFSCs)相比較，Choi等[15]發現USCs能夠分泌更多的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血小板衍生生長因子-BB(platelet-derived growth factor, PDGF-BB)，具有更強的旁分泌作用。人類白細胞DR抗原(human leukocyte antigen DR, HLA-DR)在免疫反應中起核心作用。USCs表達最低的HLA-DR，減少了觸發免疫反應的可能。同時，研究者發現在腎分化培養基中，USCs的干細胞標志物(OCT4、SSEA-4、CD117)表達隨著時間逐漸下降，腎譜系特異性標志物(PAX2、WT1、CADHERIN-6、LIM1、CD24、OCLN)表達上升，這與傳統干細胞相似。USCs不僅可以通過分泌生長因子間接影響腎臟細胞的再生，也可以直接分化為腎臟細胞發揮治療作用。因此，將USCs作為腎臟再生的干細胞來源是較好的選擇。在順鉑誘導的急性腎損傷大鼠模型中，Sun等[16]將綠色熒光蛋白標記的USCs通過尾靜脈注射給予治療，并檢測到其定位在腎臟，抑制促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素6(interleukin-6, IL-6)，減少凋亡相關蛋白，如B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白(B-cell lymphoma-2-associated X, Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)，并觀察到血尿素氮、血肌酐降低，腎小球損傷減輕，腎臟功能改善。同時，在USCs移植治療毒性藥物和缺血再灌注損傷引起的慢性腎臟疾病動物模型中，觀察到USCs能抑制炎癥反應，并具有減弱氧化應激反應、抗纖維化等作用[17]。Guo等[18]發現將USCs與豬源性腎臟細胞外基質共培養后，可形成3-D腎小管樣類器官。該類器官對腎毒性藥物丙酮和順鉑敏感，為腎毒性藥物的篩選和研究提供了一種替代方法，為個性化醫學的腎臟建模和腎臟疾病的研究提供了新思路。

2.1.2 USCs在膀胱/尿道重建中的應用 USCs不僅可以用于腎臟組織損傷的修復，還可以用于膀胱或尿道的組織工程重建。據報道[6]，使用特殊培養基誘導分化USCs，USCs能夠表達尿路上皮細胞標志物(Uroplakin-Ⅰa/Ⅲ, CK7, AE1/AE3),平滑肌細胞標志物(α-SMA, Desmin)。Bodin等[19]發現USCs不僅能夠在體外誘導分化為尿路上皮細胞和平滑肌細胞。將USCs接種至細菌纖維素支架上，并且植入小鼠體內，還能觀察到多層尿路上皮樣結構形成，有助于探索組織工程尿道的建立。同時，Wang等[20]成功將USCs誘導分化為具有收縮表型的平滑肌細胞，然后接種到血管細胞外基質(vessel extracellular matrix, VECM)，并應用到兔體內進行輸尿管重建，觀察到多層尿路上皮和平滑肌組織形成。該策略可在未來用于臨床長段輸尿管的重建。

2.1.3 USCs在生殖系統中的應用 目前，干細胞對勃起功能障礙的修復作用已在多種動物模型上得到驗證，并且取得了一定的效果[21]。USCs在相關方面的研究較少。在2型糖尿病勃起功能障礙大鼠模型中，Ouyang等[22]發現向大鼠海綿體腔內注射USCs或轉染堿性成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2, FGF2)的USCs，能夠增加海綿體內皮細胞細胞和平滑肌細胞標志物表達，升高海綿體內壓和海綿體內壓/主動脈壓比值，改善大鼠勃起功能障礙。FGF2是體內誘導血管生成并促進新血管生成的重要生長因子。該研究表明USCs能夠改善勃起功能障礙可能與其促血管生成旁分泌作用相關。此外，Zhang等[23]發現海綿體腔內注射USCs可恢復海綿體血管內皮細胞的自噬活性，有助于減輕海綿體內皮細胞功能障礙，并最終改善由糖尿病引起的勃起功能障礙，這可能與USCs能改變受體細胞自噬活性作用相關。

2.2 USCs在骨骼系統修復方面的應用

近年來，USCs成為骨與軟骨組織修復的良好候選細胞。Sun等[24]成功從同一個體中分離出USCs和骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)。在體外實驗中，USCs與BMSCs相比具有更好的增殖、集落形成和遷移能力，BMSCs與USCs相比具有更好的成骨、成軟骨和成脂肪能力。然而，體內軟骨再生修復是一個復雜的過程，與植入物與宿主細胞的相互作用、免疫反應、局部營養供應等各種因素相關。為進一步探索體內促軟骨生成效果，研究者將載有USCs或BMSCs的脫細胞軟骨細胞外基質支架植入兔膝關節軟骨缺損模型，12周后發現兩者之間的軟骨修復效果沒有顯著差異。這表明了USCs替代傳統干細胞進行軟骨修復的潛力。USCs的成骨和成軟骨分化機制復雜，是多種信號通路共同作用的結果。目前相關與這方面的研究較少，仍需更多的研究來證明。

2.3 USCs在創面修復方面的應用

創面修復是一個動態、連續的過程，目標是實現組織的再生和功能的恢復，包括3個階段: 炎癥、增殖和組織重塑。新血管的形成是傷口愈合中的關鍵步驟，而血管內皮細胞在再生組織的血運重建中起著關鍵性作用。研究表明，USCs可分泌促血管生成因子，并且在體外、體內都能分化為功能性內皮細胞，是血管生成和血管組織工程理想的自體細胞來源[25]。在創面修復的研究組，USCs常常與其他生物制劑聯合使用，進一步提高治療效果。Fu等[26]將負載USCs的聚己內酯/明膠(polycaprolactone/gelatin, PCL/GT)覆蓋兔全層皮膚缺損，效果明顯優于單一PCL/GT覆蓋或USCs移植，可觀察到傷口閉合加快，上皮化加速，膠原蛋白含量和血管生成增加。還同時發現USCs上清液富含血管生成相關因子，如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、轉化生長因子β1(transfo-rming growth factor beta 1, TGF-β1)，可促進人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)增殖、遷移、管形成等。

3 尿源干細胞來源的細胞外囊泡在再生醫學中的應用

EVs是細胞旁分泌功能產生的納米級膜泡，其內攜帶多種生物活性物質，如微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、蛋白質和脂質等，通過細胞間通訊調節靶細胞的生理、病理過程[27]。根據EVs的合成和釋放方式，分為起源于內吞途徑的外泌體、質膜釋放的微囊泡和凋亡產生的凋亡小體3種亞型。常見的分離提取方法有差速超速離心法、密度梯度離心法、超濾法、尺寸排除色譜法、免疫吸附法和沉淀法等[28]。國際細胞外囊泡學會(The International Society for Extracellular Vesicles, ISEV)的最新“細胞外囊泡研究共識”表明[29]，每一種分離方式都有其自身的優勢與缺陷，不存在絕對最佳的分離方法，研究者應根據后續的應用條件自行選擇。研究結果表明，干細胞可能通過旁分泌功能分泌EVs發揮生物學效應。

USCs-EVs是由USCs分泌，直徑30～150 nm之間的脂質雙分子層納米結構囊泡，攜帶了大量USCs相關的生物活性成分。USCs-EVs能夠釋放生物活性物質，激活胞內相關信號通路，進而調控細胞的功能和生物學行為，如細胞增殖與凋亡、血管生成、炎癥反應、免疫應答等[30-31]。在TGF-β1誘導佩羅尼氏病(Peyronie’s disease, PD)大鼠模型中，Yang等[32]通過注射USCs-EVs發現可減輕由TGF-β1/Smad信號通路引起的纖維化，抑制成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，可明顯改善白膜纖維化并增強勃起功能。在USCs-EVs修復組織損傷的研究中，多種miRNAs也發揮了重要作用。Li等[33]進行體外實驗證明，USCs-EVs通過傳遞其包含的微小RNA-146a-5p(miR-146a-5p)等多種miRNA，降低白介素-1受體相關激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1, IRAK1)，繼而抑制核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)信號通路的激活，保護人腎皮質/近端小管細胞(human kidney cortex/proximal tubule cells, HK2)免受傷害。除抑制炎癥反應外，Duan等[34]研究表明USCs-EVs富集miR-16-5p等多種miRNAs，可通過抑制VEGFA，進而改善高葡糖誘導人足細胞(human podocytes, HPDCs)凋亡，為糖尿病腎病的治療方案提供新見解。USCs-EVs能夠利用USCs的有效成分，促進損傷細胞再生，加速器官組織修復，可作為再生醫學的新型無細胞治療(cell-free therapy)方法，具有很大的應用前景。但目前研究數據較少。USCs-EVs對于組織再生的治療效果及其機制還需進一步評估。

4 結 語

USCs作為一種較新的理想干細胞來源，能夠為組織、器官的修復與再生提供新希望，為干細胞的臨床轉化和再生醫學方面提供了新的方向。

但是在真正應用于臨床前，許多問題均需要繼續展開相關實驗進行研究。例如，USCs分離與培養方法的優化、鑒定標準的確立、質量判斷的統一等。此外，旁分泌衍生物USCs-EVs高效提取方法的改進、提取成本的節約、儲存活性的保持等也需進一步改進。在許多實驗研究中，USCs與USCs-EVs的移植方式、數量、頻率、與其他生物材料結合的最佳方式還處于探索階段，未形成基本共識。這些都有待于更多的體外實驗和體內實驗來探索和研究?？偟膩碚f，USCs及其USCs-EVs在臨床中的實際應用中尚處于起步階段，真正走向臨床還有很多問題需要解決。