子宮內膜容受性檢測對于反復種植失敗的有效性研究及影響種植窗的臨床因素分析

白 云，李 蕾，吳月蓉，鐘蘭萍

（云南省第一人民醫院/昆明理工大學附屬醫院生殖醫學科，云南 昆明 650032）

反復種植失?。╮epeated implantation failure，RIF）目前多將其定義為在輔助生殖治療中移植3次以上或移植高評分卵裂期胚胎數4～6 個或高評分囊胚數3 個及以上均失敗者[1]。因為RIF 涉及病因種類多、范圍廣是體外受精-胚胎移植術（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）治療中的難題，胚胎的著床依賴于優質的胚胎和具有容受性的子宮內膜。目前隨著輔助生殖胚胎實驗室技術的發展和胚胎種植前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing，PGT）的廣泛應用，在選擇優質胚胎方面已獲得較大進展。但對于子宮內膜容受性的評估尚缺乏有效手段。國內億康基因公司于2019 年開發的子宮內膜容受性檢測（endometrial receptivity test，ERT）技術，是基于RNA-seq 的子宮內膜容受性檢測，通過分析子宮內膜組織中萬余個基因的表達量，結合AI 機器學習的大數據分析方法，區分容受前期、容受期、容受后期3 個時期的樣本，在患者下一個月經周期按照ERT 結果制定個性化移植方案時間，得到胚胎最佳的移植時期，指導在種植窗移植胚胎，以期提高移植成功率[2]。通過該技術能否確實提高RIF 患者的成功率，內膜種植窗口期發生移位的患者有什么臨床特點？是否能通過臨床信息挖掘找尋種植窗移位的相關原因從而預防RIF 的發生？目前此方面研究尚少，本研究首先通過分析RIF 患者行ERT 后胚胎移植的妊娠結局了解該技術的有效性，其次分析胚胎種植窗移位患者的臨床特點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2020 年12 月至2021 年11 月在云南省第一人民醫院生殖醫學科診斷為反復種植失敗后再次接受冷凍胚胎移植病例。入選標準：（1）取卵年齡小于40 歲；（2）反復種植失敗的患者，即既往≥3 次的移植（包括新鮮胚胎移植和冷凍胚胎移植）失敗，累積移植：①優質D3 胚胎4～6個②高評分囊胚（4BB 及以上囊胚）3 個及以上均失??；（3）診斷RIF 后再次行冷凍胚胎移植。排除標準：（1）男女雙方染色體核型異常；（2）有子宮內膜病變者（包括宮腔粘連、子宮內膜增殖癥、子宮內膜息肉、子宮內膜炎、子宮內膜結核等）未治療；（3）有輸卵管積水且未行輸卵管近端結扎者；（4）有粘膜下肌瘤未處理。根據是否接受ERT 并完成個性化移植分為接受組和未接受組。本研究已通過醫院倫理委員會審批，受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 內膜監測及手術時間安排月經來潮8～10 d，B 超監測卵泡及內膜厚度，若有優勢卵泡發育監測至排卵，排卵+5d 或出現LH 峰+7 d安排內膜取材；若無優勢卵泡發育，予激素替代周期，口服戊酸雌二醇（補佳樂，德國拜耳）4 mg/d，激素使用10～14 d，內膜≥8 mm 時給予黃體酮軟膠囊（安i 琪坦，法國Capsugel）400 mg/d、地屈孕酮片（達芙通，荷蘭Abbott，）20 mg/d，轉化內膜6 d 后安排內膜取材。

1.2.2 內膜取材手術當天行陰道分泌物、血常規檢查。手術室患者取膀胱截石位，常規消毒鋪巾，宮頸鉗鉗夾宮頸上下唇固定宮頸，探針探查宮深，順子宮位置方向輕柔插入內膜取材取樣器，待取樣器底部達宮底處，左手握住并固定管套，右手握住手柄，快速向外拉管芯使宮腔形成負壓吸取內膜組織。將取樣管中的子宮內膜組織排除至無菌紗布上，挑選干凈無血污染的內膜組織直接放入裝有RNA 保存液的保存管，放入-20℃保存，聯系送檢取樣。

1.2.3 再次冷凍移植根據ERT 結果安排再次冷凍移植，依照取內膜周期內膜準備方式再次行冷凍移植內膜準備，根據ERT 結果安排患者個性化移植時間。

1.2.4 妊娠判定移植后2 周測定血β-人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG），若β-hCG≥10 mIU/mL 為生化妊娠，于移植后28～35 d 行經陰道腔內B 超檢查是否有宮內孕囊，有孕囊者判定臨床妊娠。

1.2.5 研究變量患者的一般資料包括年齡、BMI、不孕類型、合并多囊卵巢綜合癥、合并子宮內膜異位癥、移植胚胎個數、移植胚胎類型、移植日內膜厚度、臨床結局包括臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%；種植率=孕囊數/移植胚胎胚胎數×100%（若單胚移植出現多孕囊，記為1）。納入種植窗移位多因素回歸分析的研究變量參考目前研究顯示與胚胎種植相關的臨床因素。

1.3 統計學處理

本研究統計分析采用R 語言（Version 3·6·3;）。采用表示符合正態分布的計量資料。當方差齊時，采用獨立樣本t檢驗比較組間差異，當方差不齊時采用Cochran 矯正t檢驗比較組間差異。計數資料用百分率表示，采用卡方檢驗或Fisher確切概率法進行分析。不符合取自然對數變換再行t 檢驗，仍不符合正態分布，應用Mann-WhitneyU 檢驗。針對建模人群，采用單因素/多因素Logistic 模型分析影響種植窗移位的因素。P＜0.05 為差異有統計學意義?；貧w分析中將原發不孕賦值為“1”，繼發不孕賦值為“2”；將宮外孕史、合并多囊卵巢綜合征、合并子宮內膜異位癥中不合并賦值為“0”，合并賦值為“1”；將發生卵泡不破裂黃素化賦值為“1”，未發生賦值為“0”。

2 結果

2.1 2 組病例一般臨床資料比較

接受ERT 組43 例，未接受組29 例，2 組間患者的年齡、BMI、不孕類型、多囊卵巢綜合征占比、子宮內膜異位癥占比、移植胚胎數、囊胚占比、移植日子宮內膜厚度相比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 2 組病例一般資料的比較[（）/n（%）]Tab.1 Comparison of general data of two groups of cases [（）/n（%）]

表1 2 組病例一般資料的比較[（）/n（%）]Tab.1 Comparison of general data of two groups of cases [（）/n（%）]

2.2 2 組病例臨床妊娠率和胚胎種植率比較

接受ERT 并完成個性化移植的病例臨床妊娠率及胚胎種植率均明顯高于未接受組，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 2 組病例臨床妊娠率和胚胎種植率比較n[（%）]Tab.2 Comparison of clinical pregnancy rate and embryo implantation rate between two groups [n（%）]

2.3 內膜種植窗移位相關因素多因素分析

接受ERT 檢測的43 例病例中有16 例ERT 結果為內膜容受性發生移位。其余29 例ERT 檢測結果提示內膜位于容受期內。

納入既往研究發現與胚胎種植相關的影響因素包括：年齡、BMI、不孕類型、有無宮外孕史、合并多囊卵巢綜合征（ploycystic ovary syndrome，PCOS）、合并子宮內膜異位癥、是否發生卵泡未破裂黃素化（luteinized unruptured follicle，LUF）、移植（取材）日子宮內膜厚度、移植（取材）日血孕酮水平。單因素Logistic 回歸分析結果顯示，合并PCOS、發生LUF 以及取材日血孕酮水平會影響內膜種植窗；多因素模型檢驗，合并PCOS、發生LUF 是內膜種植窗移位的影響因素，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 影響種植窗移位的多因素回歸分析結果Tab.3 Regression analysis results of multiple factors affecting the displacement of planting window

3 討論

子宮內膜容受性是指子宮內膜接受胚胎植入的能力，也是指內膜的一種狀態也稱為胚胎著床“窗口期”。一般認為在正常的月經周期中，只有在周期的第20～24 天或黃體生成素峰（luteinizing hormone，LH）后第7 天（LH+7）或P +5 子宮內膜具備對胚胎的接受能力[3]。既往認為種植窗是恒定的，然而越來越多的研究發現并非在所有患者中都成立，有的表現為種植窗提前退后或縮短[4-5]。目前臨床上檢測內膜容受狀態最常用的是超聲指標，根據內膜厚度、分型、血流，同時參考雌激素及LH 等激素指標。此外還有形態學標志物：胞飲突；分子生物學標志物；整合素等，可以一定程度評估子宮內膜容受性，但是因其存在局限性且重復性差故存在爭議。尋求一種全面客觀的檢測方法以評估子宮內膜容受性顯得尤為迫切和重要

本研究分析既往因RIF 接受ERT 檢測并進行個體化移植的病例資料提示，相比較同期未接受ERT 移植組，臨床妊娠率（53.49% vs 24.14%）和胚胎種植率（46.67% vs 20.00%）均有顯著提高，具有統計學意義（P＜0.05）。這與既往國內研究結果相符[2,6]，這個結果驗證了對于RIF 人群，ERT 準確識別種植窗對于改善這類患者結局具有重要意義，為生殖領域引入個體化種植窗及個體化移植概念，打破以往種植窗恒定的想法，能夠使RIF患者達到更有利的生殖結局，這也為生殖醫學中的精準醫療提供了新的思路。

多囊卵巢綜合征（ploycystic ovary syndrome，PCOS）是一種以排卵功能障礙和雄激素過多為特征的內分泌代謝紊亂疾病。生理情況下女性排卵后，子宮內膜在雌孕激素的作用下向分泌期轉換，子宮內膜基質細胞在分泌中期發生自發性蛻膜化，這是進入內膜種植窗的標志，雌孕激素對于子宮內膜的作用是前提[7]。目前有研究已證實PCOS患者子宮內膜容受性下降與孕激素抵抗效應有關[8-9]。Savaris 等[10]通過微陣列比較正常妊娠女性和PCOS 接受人工激素替代周期或接受克羅米芬藥物促排的子宮內膜基因表達發現，PCOS 患者子宮內膜中受孕激素調控基因如GRB2 相關結合蛋白1（GAB1）、MIG6、白血病抑制因子（LIF）等表達明顯低于正常妊娠女性。PCOS 患者內膜發生孕激素抵抗的機制可能為孕激素缺乏、孕激素受體表達改變、孕激素受體信號通路異常及胰島素抵抗[8]。另外，在胚胎移植內膜準備方案中，因為PCOS 患者稀發排卵或無排卵的原因需采用激素替代方案準備內膜，孕激素均由外源藥物天然孕酮提供，相較于自身發育卵泡形成黃體的內源性孕激素，用藥后血藥濃度不穩定以及孕激素作用內膜時間縮短可能是這類患者發生種植窗移位的潛在因素。這為臨床中對于合并PCOS 的RIF 患者的診療提供了新的思路：孕前充分的生活方式干預和藥物治療改善胰島素抵抗是改變這類患者妊娠結局的基石，此外對于重復相同激素替代周期方案的PCOS 患者，再次移植可選擇促進卵泡發育的促排周期或誘導排卵周期改善黃體功能以降低孕激素抵抗對種植窗移位產生的影響。

1975 年首次報道發育正常的成熟卵泡不破裂而黃素化（luteinized unruptured follicle，LUF），提示黃體形成并非所有經過排卵過程[11]，部分卵泡未完成排卵即形成黃素化囊腫。而孕激素水平較低是LUF 的激素變化特點。Xu 等[12]發現相較于正常排卵對照組女性，兩者血清雌二醇水平無顯著差異，但LUF 患者血清孕酮水平明顯降低，LUF 患者子宮內膜整合素αvβ3 表達強度顯著低于對照組，且與血清孕酮水平相關。整合素αvβ3 表達具有細胞周期特異性，與子宮內膜容受性密切相關，被認為是最具代表性的黏附分子和內膜容受性的標志物。雖然LH 峰出現至排卵的時間有個體差異，但LUF 周期 LH 峰低且較正常排卵者出現晚，這可能導致子宮內膜轉型不充分蛻膜化程度低，從而影響胚胎種植窗。但余蘭等[13]通過比較凍融胚胎在自然排卵周期和LUF 周期的臨床結局認為對于LUF 周期以明確的LH 峰降低為依據來確定解凍移植周期以及加強LUF 周期的黃體支持能使LUF 周期獲得與自然排卵周期相似的臨床結局。

同時，本研究存在一定的局限性，由于研究樣本例數的限制，有部分結果缺乏統計學差異，后期擬進一步擴大研究范圍，完善相關參數的比較。

綜上所述，ERT 結合個性化移植方案對于改善RIF 助孕結局具有肯定意義；合并PCOS 和發生LUF 是子宮內膜種植窗移位的危險因素。