林可霉素基因工程研究的新進展

蔡新露 許婉蓮 許玉榮 吳杭,* 張部昌

(1 安徽大學 生命科學學院 物質科學與信息技術研究院，合肥 230601；2 合肥師范學院 化學與化學工程學院，合肥 230601)

1962年，Marson等[1]從美國內布拉斯加州林肯市附近的土壤中分離得到了第一株林可鏈霉菌NRRL2936(Streptomyces lincolnensis NRRL2936)，該菌株產生一種林可酰胺類抗生素—林可霉素A(lincomycin A, Lin-A)(圖1)，體內和體外對革蘭陽性菌作用均較強，對革蘭陰性菌亦有一定的抑制作用。在臨床上，林可霉素對由革蘭陽性菌引起的疾病，如呼吸道、皮膚及軟組織感染等均有良好療效，也可用于治療慢性骨髓炎、腦膜炎、泌尿系統革蘭陽性菌感染、中耳炎和眼科疾病等，是一種用途極其廣泛的抗生素藥物[2]。林可霉素A通過與敏感細菌核糖體50S亞基的23S rRNA中心環結合，降低肽基轉移酶的活力，使肽鏈的延伸受阻，從而抑制細菌的蛋白質合成[3]。林可鏈霉菌發酵過程中除了林可霉素A，還產生其副產物林可霉素B(lincomycin,Lin-B)(圖1)。中國藥典和美國藥典規定，當林可霉素制劑中林可霉素B含量超過5%時[4]，該產品不得作為藥物或有效的藥劑學成分，因此降低林可霉素B的含量是一個亟須解決的問題。自2017年起，林可霉素野生菌以及高產菌株的基因組測序相繼完成[5-6]，這為林可霉素基因工程研究帶來了新的機遇?；诮陙碓擃I域諸多的研究進展，筆者簡述了林可霉素生物合成及其調控機制，并結合所在實驗室的研究工作，對利用基因工程技術進行林可霉素高產工程菌構建和新衍生物創制等方面的進展進行總結和展望，為林可鏈霉菌的進一步遺傳改良及其發酵生產提供參考。

1 林可霉素的生物合成

林可霉素A是由丙基脯氨酸(propyl-L-proline,PPL)和林可酰胺(lincosamide, LSM)通過酰胺鍵連接，并以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)為甲基供體對丙基脯氨酸N端和林可酰胺末端巰基甲基化修飾而成。Peschke等[7]和Koberska等[8]先后對林可鏈霉菌78-11和ATCC25466的林可霉素生物合成基因簇(lincomycin biosynthetic gene cluster, lmb cluster)進行測序，發現lmb基因簇含25個結構基因、3個抗性基因和1個調節基因lmbU(圖2)。迄今為止，林可霉素生物合成途徑已被研究得非常清楚[9-11]。

在PPL的生物合成中，LmbB2首先與輔因子共同作用于酪氨酸[12]，使之羥基化，形成多巴[13]。LmbB1使多巴2和3位碳上的氫鍵斷裂、氧化，并內部環化形成脯氨酸雙氫丙酮酸[14-16]。C-甲基轉移酶LmbW作用脯氨酸C4位支鏈，是造成林可霉素A和B差異的關鍵點[4]。LmbA將谷氨酸轉移至底物中，致使草酸鹽裂解，形成脯氨酸雙氫乙烷，隨后LmbX使雙鍵發生轉移，經LmbY作用對含氮五元環內和環外的兩個雙鍵依次還原，形成PPL[16]。

磷酸果糖或7-磷酸景天庚酮糖和5-磷酸-D-核糖在轉醇醛酶LmbR作用下發生縮合，異構化后形成穩定的8-磷酸辛糖，LmbP對其C1位的羥基磷酸化后生成二磷酸辛糖[17]，LmbK水解二磷酸辛糖的C8上的磷酸基團，經LmbO作用轉化為GDP-辛糖[18]，隨后LmbM、LmbZ、LmbM和LmbS依次參與C6異構、脫水、C4異構和轉氨反應，最終生成GDP-LSM[10]。

林可酰胺與丙基脯氨酸的縮合過程較為獨特，需要轉化為活性形式參與縮合。PPL經LmbC活化為PPL-AMP，而LSM的活化需要一種小分子硫醇麥角硫因(ergothioneine, EGT)和轉移酶LmbT參與，生成EGTLSM，后由LmbD催化，在LmbN上縮合形成PPLLSM-EGT復合物，隨后，與另一種小分子硫醇放線硫醇(mycothiol, MSH)發生硫醇交換，生成PPL-LSMS-MSH，該反應使得目的產物獲得了硫元素[19-20]。PPL-LSM-S-MSH在酰胺酶作用下發生水解反應，釋放MSH中的氨基葡萄糖肌醇[19,21]，LmbJ修飾丙基脯氨酸中吡咯環的氮元素，使之甲基化[22-23]，LmbF斷裂S-C鍵，生成去甲基林可霉素[24]，LmbG對巰基甲基化，最終形成林可霉素A[24-25]。

2 林可霉素生物合成的分子調控

近年來，林可霉素生物合成的分子調控有了很大進展。侯兵兵等[26]發現LmbU不僅可以直接激活PPL相關基因lmbA、lmbC、lmbJ和lmbW的轉錄，還間接抑制LSM相關基因lmbK及其自身的轉錄；通過蛋白截短等實驗證實LmbU的N段為自我抑制結構域(auto-inhibitory domain, AID)，C端為一個未知結構域，在蛋白中央還含有一個DNA結合結構域(DNAbinding domain, DBD)；經氨基酸點突變確定LmbU的第12位半胱氨酸是其形成同源二聚體的關鍵位點[27]。林春燕等[28]基于RNA測序分析，發現LmbU激活19種林可霉素合成基因簇外基因的表達，并通過抑制羥苯丙酮酸雙加氧酶HdpA的基因轉錄加速PPL的生物合成。林可鏈霉菌中全局調控子BldA通過控制含TTA密碼子基因如結構基因lmbB2和調控基因lmbU的翻譯，調控林可霉素生物合成和菌株形態分化[29]。另一種全局調控子AdpA既可激活簇內結構基因、抗性基因和調控基因的轉錄，還能夠促進bldA的表達，正向調控林可霉素的生物合成[30]。近期，侯兵兵等[31]發現了一個氧化還原感應調控因子Rexlin，在林可鏈霉菌NRRL 2936中敲除該基因，突變株的生長速率提高，而產量卻有所降低；并證實Rexlin間接促進簇內結構基因和調控基因的轉錄影響林可霉素的產量。

在抗生素合成過程中，添加一定量的硝酸鹽可影響抗生素產生菌的初級代謝，從而提高抗生素產量，這就是“硝酸鹽效應”，而同樣現象也出現在林可鏈霉菌中[32]。孟思童等[5]對氮代謝全局性調控因子GlnR進行了研究，結果發現硝酸鹽特異性轉運蛋白將硝酸鹽內運至細胞內誘導glnR的高效表達，GlnR進而促進該轉運蛋白基因的轉錄，以加速菌體內硝酸鹽濃度的進一步提高；GlnR通過提高硝酸鹽同化途徑相關基因的轉錄水平，可提升細胞內谷氨酸的水平，而谷氨酸經轉氨作用可形成林可霉素合成前體酪氨酸；同時，GlnR還可直接正調控抗性基因lmrA的轉錄表達，促進林可霉素的外排并提高菌株的抗性。

本實驗室發現了與林可霉素生物合成相關的3種轉錄調控因子(SLCG_2919、BldD和SLCG_Lrp)。TetR家族調控子SLCG_2919可直接抑制林可霉素合成基因簇以及鄰近基因SLCG_2920的轉錄，從而負調控林可霉素的生物合成[33]。林可鏈霉菌BldD作為一個重要的發育調控因子，直接正調控林可霉素的生物合成[34]。亮氨酸應答調控蛋白SLCG_Lrp一方面直接促進林可霉素合成基因簇中部分結構基因、全部3個抗性基因和調控基因lmbU的轉錄，另一方面直接抑制自身基因并激活鄰近基因SLCG_3127的轉錄。此外，SLCG_Lrp還受到SLCG_2919直接的轉錄調控作用[35]。本文基于上述研究結果繪制了林可霉素生物合成的局部調控網絡(圖3)。

3 林可霉素產量與純度的提高

3.1 增加胞內硝酸鹽濃度

在林可霉素發酵過程中，添加一定濃度的硝酸鹽可以使其產量明顯提高。孟思童等[5]發現了一種硝酸鹽特異性ABC轉運蛋白ABC2，它可以內運硝酸鹽，使胞內硝酸鹽濃度提高，從而增加林可霉素產量。已有研究報道亞硝酸鹽特異性內運蛋白NirC在克氏桿菌DSM 10542[36](Sanguibacter keddieiiDSM 10542)、暗地嗜皮菌DSM 43160[37](Geodermatophilus obscurusDSM 43160)和地中海擬無枝酸菌U-32[38](Amycolatopsis mediteraneiU-32)等多種菌中均參與氮代謝。在林可霉素高產菌LC-G中共表達ABC2和nirC，胞內硝酸鹽濃度升高，GlnR高效表達，致使林可霉素產量大幅提高[5]。

3.2 調控與抗性基因改造

侯兵兵等[26]在解析LmbU調控機制的基礎上，于野生菌NRRL2936中過表達該基因， 林可霉素產量提升了5倍。本實驗室在林可霉素高產菌株LA219X中敲除SLCG_2919或增加SLCG_Lrp基因拷貝數，可使林可霉素A產量分別提高15%和14%[33,35]。另外在林可霉素高產菌株LC-G中過表達抗性基因lmrC，可增加菌株對林可霉素的耐受力[39]，而杜磊等[40]利用將含抗性基因lmrA、lmrB和lmrC的多拷貝質粒和整合質粒依次轉入林可霉素野生菌ATCC25466中，林可霉素A產量先后提高了52.9%和38.3%。

3.3 代謝前體基因及結構基因改造

林可霉素生物合成基因簇中存在3個依賴SAM的甲基轉移酶基因(lmbW、lmbJ和lmbG)，說明在林可霉素合成過程中甲基的供給必不可少。一般來說，SAM是由metK編碼的多數甲基化反應的唯一甲基供體[41]。逄愛萍等[4]根據已報道的鏈霉菌metK序列設計兼并引物，PCR擴增得到林可鏈霉菌的metK基因，在林可鏈霉菌SyBE2901中共表達該基因和lmbW，林可霉素A產量達到1744.6 mg/L，較出發菌株提高了35.83%，林可霉素B含量由6.76%降至4.41%。筆者實驗室在林可霉素高產菌株LC-G中發現了兩個metK同源基因metK1和metK2，并在高產菌株LCGL和LA219X中共表達metK1和metK2，林可霉素A產量分別提高了27%和17%[42]。

L-多巴既可作為雙加氧酶LmbB1的底物用于合成林可霉素，也可作為黑色素前體被酪氨酸酶作用。在林可鏈霉菌中過表達lmbB1，搖瓶發酵時林可霉素A產量提高不顯著，但副產物林可霉素B和黑色素的合成被抑制；而15L發酵罐發酵時林可霉素A的產量提高了37.6%，林可霉素B和黑色素分別降低了73.4%和29.9%[43]。

本文基于上述研究結果匯總了林可霉素高產菌株基因工程改造的實例(表1)。

表1 林可霉素高產菌的基因工程改造Tab.1 Genetic engineering of lincomycin overproducing strains

4 新型林可霉素衍生物的創制

林可霉素衍生物，如克林霉素具有極大的藥用價值，是少數幾個在臨床上用于治療革蘭陰性厭氧菌的藥物之一。然而，傳統的化學合成法提取過程繁瑣且污染嚴重。因此，亟需一些有效的方法用于合成林可霉素衍生物。目前已報道使用生物催化或微生物發酵法合成林可霉素衍生物。

天青鏈霉菌(Streptomyces azureus)磷酸吡哆醛依賴酶CcbF和林可鏈霉菌LmbF同源性高達40%，它們以不同的方式作用底物，并與下游酶共同催化，使各自的產物天青菌素和林可霉素A具有獨特硫功能化，CcbF行使雙功能酶的職能，既脫羧又氧化脫氨；LmbF負責β消除，斷裂C-S鍵[24]。在體外，這兩種硫功能化過程可以交叉使用，王敏等[24]以此為基礎，整合已知的酶功能，在體外合成了多種新的林可酰胺類抗生素。

研究發現對林可霉素及其衍生物中脯氨酸烷基鏈長度和結構的修飾可能影響其抗菌活性[16]，Dana等[44]在林可鏈霉菌中敲除lmbX致使其無法產生林可霉素，通過回補實驗證明這是由于林可霉素前體4-丙基脯氨酸的合成被阻斷；在ΔlmbX突變株發酵液中添加前體衍生物丁基脯氨酸和戊基脯氨酸，可產生高濃度的4-丁基-4-去丙基林可霉素和4-戊基-4-去戊基林可霉素，它們在抗葡萄球菌方面比林可霉素更加有效。

Janata等[45]基于對天青菌素生物合成中關鍵酶的機制解析，使用酶催化方法制備了數百種林可霉素衍生物，并發現對其結構中MTL的C1位引入烷基水楊酸酯或PPL的C4′位引入碳長為4-6的烷基，可提高林可霉素衍生物的抗菌活性。

5 總結與展望

林可霉素類藥物作為高效抗生素已被廣泛應用于畜禽獸醫臨床方面，具有較大的市場份額。我國是林可霉素發酵生產的大國，但面臨發酵效價偏低、組分復雜等問題。目前林可霉素生物合成途徑已經非常清晰，其異源雙相前體凸顯了林可霉素合成代謝通路的多樣性，這為林可霉素高品質育種奠定重要基礎。盡管通過林可鏈霉菌基因工程改造優產林可霉素已有一些報道，但相對于其他鏈霉菌還略有不足。近年來，除了林可霉素野生菌NRRL2936，迄今有兩株林可霉素高產菌的全基因組被測序完成[5-6]。王瑞達等[6]基于比較基因組分析，在高產菌B48中初步發現了影響其林可霉素產量的關鍵因素，其中基因調控對林可霉素菌種的高產至關重要，這為林可鏈霉菌系統的代謝工程改造提供理論依據?？v觀已有林可霉素生物合成調控的研究進展，其已然呈現出多元的分子機制，這進一步凸顯了林可霉素合成調控的復雜性。而功能基因組學[46-48]、指數富集的配體基因組系統進化技術[49]、DNA親和捕獲實驗[50-51]等系統生物學方法的應用，將有助于深化對林可霉素合成代謝調控網絡的認識。在此基礎上，運用合成生物學的理念，通過關鍵調控元件設計與優化及其分子網絡的重塑，將有助于顯著提升林可霉素的微生物制造水平。

雖然近年來林可霉素基因工程研究進展較快，但仍有一些問題亟待解決。通過基因工程手段改造林可霉素工業菌株，如何進一步降低林可霉素B等副產物或雜質的含量？工業菌株在多次傳代和發酵過程中如何穩定優產性能？如何定向并高效創制更多優效的林可霉素衍生物？怎樣做到林可霉素基因工程菌與現有發酵工藝的高效匹配？解決這些問題，將為深入理解林可霉素生物合成代謝及其調控的復雜機制，以及工業菌株的高效精準與系統工程改造奠定基礎。