基于固相萃取的糧油產品前處理技術研究進展

戚欣，汪雪芳，喻理，馬飛，王秀嬪，張良曉,3,5*，李培武,3,5

（1.中國農業科學院油料作物研究所，湖北 武漢，430062；2.農業農村部油料及制品質量監督檢驗測試中心，湖北 武漢，430062；3.農業農村部油料產品質量安全風險評估實驗室（武漢），湖北 武漢，430062；4.農業農村部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室，湖北 武漢，430062；5.湖北洪山實驗室，湖北 武漢，430070）

糧油產品是人類日常飲食的必需品，是人類攝入蛋白質、脂肪和碳水化合物等三大營養素的最重要來源。以食用植物油為例，不僅富含必需脂肪酸，還含有植物甾醇、脂溶性維生素、類胡蘿卜素、酚類化合物等營養成分[1～3]。糧油產品在生產、儲藏、運輸及加工過程中受到多種危害因子污染[4]，例如真菌毒素[5～8]、農藥殘留[9]、多環芳烴類[10]、塑化劑[5]等，威脅消費者生命安全。因此，開展糧油產品質量安全檢測，對評價品質優劣和保證消費安全具有重要意義。

在糧油質量安全檢測技術中，色譜與色譜質譜聯用技術因靈敏度高、選擇性好、準確度高等優點得到廣泛應用[11]。但因目標物含量低、樣品基質復雜，對樣品進行凈化、分離、富集等前處理十分必要。固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）利用待測分析物與固相萃取填料之間分子作用力，先吸附在固定相上，而后通過淋洗將雜質沖洗下來，再通過合適的洗脫溶劑將待測物洗脫下來，從而達到凈化和富集的效果。萃取材料是SPE 技術的核心，是決定提取分離效率的關鍵因素。近年來，一些新型材料應用于糧油產品前處理。按照常用萃取劑的材料類型，本文對糧油質量安全檢測中SPE 技術研究進展進行綜述，分析了萃取材料的優劣，以期為提高SPE技術的性能提供借鑒。

1 傳統材料

目前，常見的用于SPE 的材料，包括硅膠、中性氧化鋁、石墨化炭黑復合材料、棉纖維等，主要通過分子作用力（極性、疏水性、離子交換），經優化淋洗液及洗脫液，去除干擾且選擇性保留目標物（表1）。采用SPE 技術，實現食用油中甾醇、白藜蘆醇、酚類化合物和磷脂等營養成分的凈化。Zhong 等[12]用商用固相萃取柱純化，采用氣相色譜串聯質譜法，測定了植物油中4 種甾醇和角鯊烯，樣品加標回收率為91%～107%，檢測限為0.3～5.87 mg/kg。Han 等[13]則使用傳統棉纖維作為固相萃取柱填料，自制注射器針筒推拉的固相萃取裝置，將花生油經6次推拉，正己烷洗滌、乙醇洗脫，低成本且環境友善地測定花生油中白藜蘆醇，方法檢出限為2.47 ng/g。Yu等[14]采用混合模式固相弱陽離子柱富集了菜籽油中的14 種酚類化合物，該方法檢測限0.10～0.30 μg/kg。Antonelli 等[15]比較了弱陰離子交換柱和石墨炭黑柱SPE 對橄欖油中磷脂的富集效果，并用液相色譜-高分辨率質譜法進行分析，結果表明，與弱陰離子交換固相萃取柱相比，石墨炭黑的萃取效果最好，共鑒定出82 種磷脂，而前者只有32 種，檢測靈敏度范圍在9～36 ng/g。丁磊等[16]使用硅膠固相萃取柱凈化，用高效液相色譜-串聯質譜儀測定了植物油中的膽固醇，經過優化后的回收率為85.2%～92.0%，檢測限為0.02 mg/kg。Dou 等[17]為鑒定調和油真偽使用中性氧化鋁固相萃取小柱，對芝麻油、花生油、大豆油及菜籽油進行凈化，建立了高效液相色譜-串聯質譜儀測定植物油中芝麻素含量的方法，最優條件的回收率大于80%，檢測限為20 ng/mL。Gorassini 等[18]為鑒別初榨橄欖油真偽，經硅膠作固相萃取小柱，用氣相色譜儀檢測橄欖油中的甾醇和三萜二醇，該方法可以快速鑒定特級初榨橄欖油。

表1 基于固相萃取的糧油樣品前處理技術Table 1 Solid phase extraction based sample pretreatment methods for grain,oilseed and their products

續表

同時，基于該類材料的SPE技術，用于食用油中多環芳烴、生物毒素、農藥殘留等危害因子檢測中樣品預處理。Rascón等[19]利用氣相色譜串聯質譜測定了植物油中的16 種多環芳烴，使用C18作為固相萃取填料，檢測限為4～110 ng/kg，回收率為87%～104%。Eyring等[20]開發了新型微固相萃取法測定葵花籽油中的多環芳烴，比較了弗羅里硅和C18作為填料的萃取效果，后者的回收率53%～118%，該方法僅使用洗脫液乙腈360 μL，且具有實驗耗時短的優點。Deng 等[21]使用石墨炭黑與N-丙基乙二胺復合固相萃取柱用于同時測定花生油中黃曲霉毒素B1、雙酚A和4-壬基酚，回收率為87.7%～105.1%，黃曲霉毒素B1、雙酚A 和4-壬基酚的相應定量限分別為0.2、1.0 和2.0μg/kg。Song 等[22]建立了C18-Al2O3復合固相萃取柱凈化，同時檢測糧食及植物油中黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮等真菌毒素的超高效液相色譜-串聯質譜方法，在最佳SPE 條件下黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮毒素的平均回收率分別為68.3%～98.6% 和84.5%～108.0%，檢測限分別為0.03μg/kg和0.3μg/kg，方法重復性良好，且實驗成本較低。Hakme 等[23]利用QuEChERS 法對谷物中大于129種農藥進行了提取凈化，利用乙腈提取，然后由無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺、C18和碳纖維作為分散固相萃取吸附劑凈化，利用氣相色譜軌道離子阱質譜儀，定量限達到0.005 mg/kg。

傳統SPE材料已廣泛應用于糧油質量安全檢測中，其優點是材料穩定性良好，成本低，缺點是選擇性差、抗基質干擾能力差、回收率較低。

2 納米材料

2.1 碳納米纖維

碳納米纖維（carbon nanofiber，CNF）是納米級的石墨狀結構的吸附材料，因其沿著纖維軸的層疊六邊形層的可變排列成多種形狀而具有不同作用，受到越來越多的關注并得到了廣泛的研究。Singh等[24]首次在負載于活性炭上的納米鎳粒子的催化作用下，利用化學氣相沉積法制備了鎳納米顆粒及活性炭與碳納米纖維的復合物（Nickel nanoparticledispersed carbon nanofibers grown on activated carbon fibers，Ni-ACF/CNF），將其用作分散固相萃取吸附劑凈化樣品，在高脂基質（花生、大豆、芝麻、亞麻籽）中，以10 mg Ni-ACF/CNF 為最佳添加量，測定了27 種農藥殘留，所有農藥殘留的回收率在72%～117%之間，檢出限和定量值分別為0.7～4.2 ng/g 和2.3～13.9 ng/g。Shelepchikov 等[25]采用含活性炭纖維和碳分子篩的雙層微柱，通過固相萃取，利用氣相色譜質譜聯用儀檢測葵花籽油中二噁英和類二噁英多氯聯苯，在雙層碳柱上進行固相萃取需較少的溶劑和吸附劑，能耐受脂肪，回收率在79～119%之間。

2.2 多壁碳納米管

多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNT）是由多層石墨片卷曲而成的碳納米管，因其具有比表面積大且化學穩定性好等優點，已廣泛作為固相萃取吸附劑用于糧油質量安全檢測[26]。楊飛等[27]采用石墨化多壁碳納米管、強陰離子交換硅膠和N-丙基乙二胺復合凈化柱，對大豆、大米中的農藥乙氧呋草黃進行分離和凈化，檢測限為6.0μg/kg，加標回收率為74.1%～121%。Dong 等[28]建立了以多壁碳納米管為吸附劑的固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定玉米、小麥和大米中4種A 型單端孢烯類化合物的方法，對不同基質中的4種樣品均有較好的凈化效果。方法的回收率為73.4%～113.7%，檢測限為0.02～0.10 μg/kg。由于碳納米管分散性較差、化學選擇性較低的特點限制了其吸附效果，因此，需對其進行物理或化學改性，或與其他材料復合，增強整體的吸附效果[29]。

2.3 石墨烯衍生物

石墨烯具有單層或多層sp2 雜化碳原子排列成蜂窩狀，其衍生物氧化石墨烯則在二維平面兩側均存在含氧基團、環氧基團和羥基，層邊緣存在羧基，使其具有更好的親水性，但容易發生團聚，降低實驗的重復性。不同相結合的石墨烯基納米復合材料很好的解決了這個問題，避免了層間π-π 堆積，有較好的水分散性[30]。Jafarian-asl 等[31]合成了磁性氧化石墨烯（magnetic graphene oxide，MGO），將其用于菜籽油中β-谷甾醇的提取，與C18和石墨炭黑相比，該復合材料對油品中β-谷甾醇的提取效果更好。Ji 等[32]采用微波增強水熱法制備了穩定的Fe3O4-氧化石墨烯，并以此為吸附劑，用磁性固相萃?。∕agnetic solid phase extraction，MSPE）富集分離植物油中的8種多環芳烴。系統研究了萃取解吸因子，在最佳條件下，檢測限為0.06～0.15 ng/g。樣品中PAHs 的加標回收率為85.6%～102.3%。Lu等[33]采用共沉淀法合成了氧化石墨烯-Fe3O4納米復合材料，并將其應用于超高效液相色譜-串聯質譜對地溝油中提取的辣椒素、二氫辣椒素和壬酸香草基酰胺進行分析。在優化的預處理條件下，檢出限為0.15 μg/L，定量限為0.4 μg/L，大豆油的回收率為81.2%～103.3%，菜籽油的回收率為71.2%～84.3%。Wu 等[34]將氧化石墨烯和羥基化的Fe3O4結合，并應用于磁性固相萃取，采用高效液相色譜法檢測芝麻油中的木脂素?？疾炝私馕軇┑姆N類、體積、解吸時間和吸附劑用量等因素對萃取效率的影響。在優化條件下，芝麻酚、芝麻素、芝麻林素的檢出限分別為0.05、0.02、0.02μg/g。芝麻酚、芝麻素、芝麻林素的平均加標回收率分別為84.55%、85.47%、86.83%。

還原性氧化石墨烯（reduced graphene oxide,rGO）是GO 經還原反應獲得的性質更穩定的一種石墨烯材料，具有大量的含氧極性基團，這些極性基團通過配位鍵、陽離子-π 鍵[35]相互作用對有機污染物的氧和氮官能團表現出最佳的吸附能力。Yu等[36]合成了磁性石墨烯納米復合材料Fe3O4/還原氧化石墨烯。將該納米復合材料作為MSPE 吸附劑，通過高效液相色譜-熒光柱后光化學衍生法測定食用植物油中的黃曲霉毒素（圖1）。在最優條件下，得到了良好的線性關系。黃曲霉毒素B1和B2的檢出限分別為0.02 μg/kg 和0.01 μg/kg，黃曲霉毒素的加標回收率為80.4%～106.0%，穩定性良好，相對標準偏差小于8.1%。

圖1 磁性石墨烯納米復合材料的MSPE原理圖[36]Fig.1 Schematic illustration of MSPE based on magnetic graphene nanocomposite

碳基納米材料作為固相萃取材料具備多種優異的吸附性能，但rGO 等容易通過π-π 堆積和范德華力作用產生不可逆的聚集，重新堆疊成石墨，且糧油基質成分復雜，有機質也會導致其團聚，所以目前石墨烯的制備工藝正在改善，而未來最重要的發展方向是加強對磁性石墨烯的表面改性，從而可使其表面具有更豐富的吸附位點，同時也可使石墨烯表面的磁性納米粒子的形態及分布更均勻，更有利于穩定發揮磁性石墨烯的功能[37]。

2.4 阿侖膦酸鈉介孔納米顆粒

阿侖膦酸鈉（alendronate sodium,ANDS）是一種用于骨質疏松和其他骨病的雙膦酸藥物。除了磷酸基團外，ANDS 的分子結構中還包含一個連接在丙基尾巴上的氨基，在非極性或低極性有機溶劑中可以通過氫鍵作用與極性化合物相互作用，基于這一特性，一些研究證明了這些磷酸化合物可以通過Lewis 酸/堿相互作用在金屬氧化物表面上強鍵合，以此增加其穩定性和表面覆蓋率。碳納米材料的制備過程中需要消耗大量濃酸，ANDS 制備過程則更溫和。Zhao 等[38]制備了介孔磁性納米顆粒Fe3O4@ANDS 將其作為磁性固相萃取吸附劑，因其表面包含氨基，通過氫鍵作用對花生油中的反式白藜蘆醇進行純化和富集，前處理時間僅需要10 min，加標回收率在78.6%～118.9%之間，該方法的檢出限為0.3 ng/g。

總之，納米材料的優勢是比表面積大，吸附作用力強，缺點為選擇性較差，親水性不足，易于形成團聚，尤其是碳納米材料，需要和其他材料結合使用。

3 高分子材料

3.1 分子印跡聚合物

分子印跡聚合物（Molecular imprinted polymer，MIP）是在結合位點及化學空間結構與某種特定化合物（模板分子）相匹配的高分子聚合物，具有優良的特異性吸附性能[39,40]，在糧油固相萃取前處理技術方面應用廣泛[41,42]。張冰等[43]使用市售的PAH MIP 固相萃取小柱，建立了同時測定植物油中11種多環芳烴的高效液相色譜熒光檢測方法，11 種組分加標回收率在63.5%～118.6%,相對標準偏差1.4%～18.2%,最低檢出限為0.03～1.50 μg/kg,定量限為0.10～5.00 μg/kg。Liang 等[44]采用碳量子點包覆偽分子印跡聚合物毛細管整體柱結合高效液相色譜-熒光檢測器測定花生樣品中的黃曲霉毒素B1，該研究將內壁經硅烷化處理的玻璃毛細管中以乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，并加入偽模板5,7-二甲氧基香豆素和功能單體甲基丙烯酸及碳量子點，制備了新型分子印跡聚合物整體毛細管柱，使用該柱不僅具有較高的回收率（79.5%～91.2%），高靈敏度（檢出限和定量限分別為0.118 ng/mL和0.393 ng/mL），且最優條件下，其富集系數高達71 倍。Alghamdi等[45]通過分子模擬軟件SYBYL，優化了分子能量，建立了α-生育酚的最小分子模型，在此基礎上利用LEAPFROG 算法篩選了22個功能單體的虛擬文庫，該算法根據分子間的相互作用確定了對目標物具有天然親合力的功能單體，最后通過甲基丙烯酸作為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯作為交聯劑，制備了分子印跡聚合物，該團隊[46]繼續將該聚合物運用于植物油中游離脂肪酸（棕櫚酸、油酸和亞油酸）、α-生育酚、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇，在最優條件下，加標回收率為94%～99%。

分子印跡聚合物的優點在于制備的原料易得，且制備過程較為簡單，特異性較好，但缺點在于分子模板難以去除，容易產生干擾，且親水性較差。

3.2 金屬有機框架

金 屬- 有 機 框 架（Metal-organic framework，MOF），是一種新型多孔晶體材料，其通過金屬中心作為節點，有機配體作為配位鍵結合而成[47]。由于其合成簡單，比表面積大，孔徑可調等特點在固相萃取吸附劑中得到了廣泛的應用[48]。Li 等[49]構建了具有核殼結構的新型磁性微復合材料Fe3O4@UiO-66-NH2@MON。將Fe3O4微球的內核包覆MOFs 晶體，然后通過sonogashira 偶聯反應將微孔有機網格引入Fe3O4@UiO-66-NH2表面，表現出良好的磁選性能，有效簡化了前處理步驟，結合高效液相色譜測定了谷物中的黃曲霉毒素（B1、B2、G1和G2），檢測限在0.15～0.87μg/L。更重要的是，MON 涂層顯著提高了整個吸附劑的親水性，從而提高了吸附效率，回收率為87.3%～101.8%。Mao 等[50]以UiO-66為吸附劑，采用分散固相萃取法，建立了QuEchers法測定植物油中有機磷農藥殘留量（圖2）。UiO-66微孔可直接選擇性吸附有機磷農藥，排除干擾化合物。洗脫得到干凈的分析物，并用氣相色譜-串聯質譜法進行分析。最優條件下植物油中OPP 的檢出限為0.16～1.56 ng/g，平均回收率為81.1%～113.5%。UiO-66 可以輕易回收和重復使用至少10次，降低了分析成本。

圖2 MOFs-DSPE-GC-MS 分析流程[50]Fig.2 Analysis flow chart of MOFs-DSPE-GC-MS

金屬有機框架的優勢在于比表面積大，吸附性能良好，孔徑可調節，能重復利用，缺點在于制備成本較高，選擇性較差，需要和其它材料配合使用。

4 生物材料

4.1 抗體材料

抗體是免疫親和固相萃取技術（immnuo affinity chromatography columns,IAC）的核心成分，其原理是將抗體固定在固相載體材料上，利用免疫親和層析原理，即利用生物大分子具有對某一類生物大分子特異識別和可逆結合的特性而制成，具有較高的特異性，因此可以更好地去除基質干擾和達到滿意的回收率[51]。Ma 等[52]通過與溴化氰激活的Sepharose 4B 共價偶聯高特異性辣椒素多克隆抗體獲得免疫吸附劑，然后裝入聚乙烯柱中，建立了免疫親和層析-液相色譜-串聯質譜聯用測定植物油中辣椒素和二氫辣椒素作為廢棄油脂摻假標記物的方法。最優條件下，辣椒素和二氫辣椒素的回收率在87.3%～95.2%之間，該方法具有較高的靈敏度，辣椒素的檢出限和定量限分別為0.02 μg/kg 和0.08μg/kg，二氫辣椒素的檢出限為0.03 μg/kg。Zhang等[53]使用多種毒素產生的單克隆抗體通過偶聯自制了多重免疫親和色譜柱，采用高效液相色譜-串聯質譜聯用方法，一次性測定黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2、赭曲霉毒素A 等7 種真菌毒素，其檢測限為0.04～0.4μg/kg，花生樣品、玉米樣品和小麥樣品的平均回收率分別為97.5%～101.7%、95.3%～98.1%和97.4%～103.3%。Yu 等[54]將Fe3O4納米顆粒與黃曲霉毒素B1抗體結合，建立了低溫清除法和免疫磁性固相萃取法（Immnuo magnetic solid phase extraction，IMSPE）測定植物油中的黃曲霉毒素B1。先將化學共沉淀法得到的Fe3O4納米顆粒被NH2基團功能化，之后用戊二醛活化，再將抗AFB1抗體接枝到顆粒表面。通過其磁性核心，抗體功能化的Fe3O4納米顆?？梢院苋菀椎厥褂糜来朋w從系統中分離出來，該方法有助于凍結來自油脂的基質干擾，并且IMSPE有助于預濃縮目標分析物。該方法的回收率在79.6%～117.9%之間，該方法的使用熒光檢測法檢出限和定量限分別為0.0048 ng/g和0.0126 ng/g。

免疫親和柱技術基于抗體的吸附劑利用抗體-抗原相互作用對分析物的高親和力，選擇性強，可有效去除干擾。然而抗體的生產需要使用動物，昂貴且耗時，重復率低且不易儲藏。計算機輔助抗原技術和納米抗體篩選是將來發展的趨勢。

4.2 適配體

適配體是單鏈核酸分子（DNA 和RNA）形成明確的三維結構，可以與特定的靶標（從單分子到整個生物體）具有高親和力和特異性，其主要優點是純度高，重復性穩定，成本相對較低，靶標通用性廣，化學修飾容易，穩定性高，適用性廣。此外，適配體是通過數富集配體系統進化在體外選擇的單鏈寡核苷酸，不需要使用動物[55]。Liu 等[56]通過氨基修飾的AFB2適配體通過共價鍵固定在溴化氰激活的瓊脂糖上采用高效液相色譜-熒光法對花生中AFB2進行測定。在最佳條件下，平均加標回收率為80.9%，檢出限為0.025 ng/mL，并且該固相萃取小柱可以重用5次，降低了成本。

適配體（Aptamer，Apt）與其他類型的納米材料結合作為固相萃取材料測定油脂油料中不同分析物具有廣泛的應用前景。Xu 等[57]構建了金納米粒子與核酸適配體功能化雜交親和整體柱，并將其應用于高效液相色譜在線特異性識別玉米赤霉烯酮，該方法對玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1共存物質干擾小。檢測限（LOD）可達0.05 ng/mL，在玉米、小麥、水稻中回收率90.9%～95.0%，且具有可重復使用的優點。Wang 等[58]制備了功能化適配體結合殼聚糖的磁性納米粒子，并用其提取、凈化分離，結合高效液相色譜熒光檢測法，測定了玉米粉中的赭曲霉毒素A，回收率可達91.3%～99.1%。Liu等[59]將功能化適配體修飾在磁性瓊脂糖微球，用于玉米中黃曲霉毒素B1、B2的富集凈化，回收率為94.8%～102.4%，AFB1和AFB2的LOD分別為0.025 ng/mL和0.010 ng/mL，該材料的優勢在于磁性微球縮短了前處理時間的同時，適配體增加了特異性吸附能力。Nasirian 等[60]制備了一種適配體與熒光聚合點共軛及cDNA 與銀離子偶聯的新型材料（Apt@polymeric dots@ cDNA-AgNPs），利用分散固相萃?。―ispersed solid phase extraction，DSPE）的方法結合熒光能量共振轉移技術檢測了小麥粉中的黃曲霉毒素B1，在黃曲霉毒素B1存在的情況下，對黃曲霉毒素B1具有高親和力的適體將從該新型聚合體中釋放出來，導致熒光開關打開。通過不同濃度黃曲霉毒素B1的熒光強度呈線性增長，故能保證精確定量且該方法極其靈敏，檢出限可達0.3 pg/mL。

核酸適配體的優勢是高親和力和高特異性，易于編輯，且制備成本較抗體低，適用范圍廣；缺點在于抗干擾能力弱。設計和篩選高特異性和高親和力的核酸適配體，與試劑盒、試紙條和微流控芯片等技術結合，實現檢測技術的微型化是將來的發展趨勢。

5 結論

糧油產品是人類日常飲食的必需品，糧油產品質量安全檢測對提升產品品質、保證消費安全具有重要意義。SPE 技術是提高檢測方法的回收率、靈敏度和特異性的重要手段。萃取材料是SPE技術的核心。本文綜述了基于SPE技術的糧油產品前處理技術。文獻綜述發現，將多種材料相互交叉結合，能取長補短，提高凈化富集效果，例如適配體與磁性材料結合，既增加了材料的特異性，又減少了前處理的時間。越來越多的新型材料在糧油產品固相萃取前處理中應用，未來根據糧油產品中目標物設計特異性、穩定性、富集率高、可循環利用的新材料，對提高糧油產品營養品質和危害因子的檢測能力具有重要的意義。