北方強冬性甘藍型冬油菜生長錐與抗寒性的關系研究

李學才，金姣姣，馬驪，武軍艷，陳其鮮，曾瑞，曾秀存，崔小茹，孫萬倉*

（1.甘肅農業大學農學院/甘肅省共建干旱生境作物學國家重點實驗室/甘肅省油菜工程技術研究中心/甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅 蘭州，730070；2.甘肅省旱地冬小麥種質創新與應用工程研究中心/省級2011協同創新中心/隴東學院農林科技學院，甘肅 慶陽，745000；3.甘肅省農業技術推廣總站，甘肅 蘭州，730070；4.河西學院，甘肅 張掖，734000）

植物的生長錐（shoot apical meristem，SAM）是植物莖頂端分生組織的一部分，其生命活動最為活躍旺盛，是植物各類器官分化、形成、發育的“發源”區域，往往呈錐形。生長錐特性是遺傳力較高的遺傳性狀，也容易受環境條件影響。多個作物上的研究發現，生長錐在形態上的變化與植物所受外界環境的影響密不可分[1，2]。對于越冬作物，生長錐的行為關系到能否越冬問題。孫萬倉等[3]研究發現，新育成的抗寒性不同的北方白菜型冬油菜品種生長錐形態具有較大差異，且一般能夠在甘肅河西走廊、北京等北方地區越冬的強抗寒白菜型冬油菜品種具有生長點凹陷、匍匐生長的特性。

生長錐的行為受一系列基因家族調控，SHOOT MERISTEMLESS（STM）和WUSCHEL（WUS）是莖分生組織發育的2 個重要基因，調控著分生組織的形成。STM基因屬于I 類KNOX 亞家族，編碼的同源域KNOX 家族蛋白能延遲分化[4]，KNATM 是擬南芥中的一個新KNOX 蛋白家族成員，只存在于雙子葉植物中[5]，能在煙草的腋芽和頂端分生組織中特異表達[6]。WUS基因編碼的同源域蛋白主要在干細胞中心表達，維持頂端分生組織中干細胞數量的動態平衡[7]，下胚軸、真葉和幼苗分生組織中STM 與WUS蛋白可以相互作用共同調控CLV3基因的表達[8]，胚胎中的WUS 是CLV3 的唯一激活因子。當CLV3 蛋白積累到一定量之后會反過來抑制STM基因與WUS基因的表達，這種反饋環使頂端分生組織大小適宜又連續不斷[9,10]。CUC2（CUP-SHAPED COTYLEDON2）屬于植物特有的NAC 家族NAM 超家族成員，在植物頂端分生組織的形成、器官原基的形成和葉邊緣形態建成中發揮重要作用[11～13]，轉NAM基因的番茄植株矮小，頂端分生組織的形成受到抑制[14]。CUC2、STM、WUS、CLV3之間形成一定的反饋關系，可相互作用共同調節頂端分生組織的發育，如擬南芥的缺失突變體trn1-3，其頂端分生組織的相關標識基因CLV3、WUS、STM等表達量發生異常[15]。NAC 轉錄因子成員NAM和CUC1/2/3基因調控著植物的根、莖、葉、花和果實發育，如矮牽牛nam-突變體不能形成頂端分生組織[16]，SNAC 家族基因NAC47和NTL 家族基因NAC62能提高轉基因植株的耐凍性。

北方地區冬季嚴寒，干旱少雨（雪），冬油菜越冬條件嚴酷。強冬性白菜型冬油菜新品種越冬期生長錐凹陷，有利于抗御北方地區冬季的劇烈氣溫變化和土壤溫度變化，保障安全越冬[17]。甘藍型冬油菜品種的植物學形態與生物學特性不同于強冬性白菜型冬油菜品種。在河北石家莊及甘肅慶陽等地試驗發現，長江流域及黃淮海的甘藍型冬油菜品種在北緯35°左右的北方地區種植，表現為生長錐凸起，不能越冬，而部分生長錐較低品種則可安全越冬并獲得較高產量[3]。因此，研究強冬性甘藍型冬油菜生長錐與抗寒性之間的關系，對北方甘藍型冬油菜的品種選育具有重要理論意義和應用價值。該研究通過觀察強冬性甘藍型冬油菜生長錐形態、測量其高度，分析生長錐相對高度與抗寒性之間的相關性，克隆生長錐調控基因，并進行功能分析，以期明確甘藍型冬油菜生長錐在抗寒中的重要作用及其關鍵調控基因表達模式，為強冬性甘藍型冬油菜強抗寒品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及菌株載體

選用了12個冬性不同的甘藍型冬油菜品種，包括強冬性材料VHTSG10、VHNTS158、VHNS45-4、VHNPZ269-1、VHTS309-10、VH8(G)、VH 天油2266和VHTS309-4；冬性材料VHTS309-3 和VHTS312-2；弱冬性材料VH 天油2288和VH 新油23號。根據前期研究[18]，依據半致死溫度（LT50）確定該12 個材料的抗寒性由強到弱依次是：VHTSG10 ＞VHNTS158 ＞ VHNS45-4 ＞ VHNPZ269-1 ＞VHTS309-10 ＞VH8(G)＞VH 天油2266 ＞VHTS309-4 ＞VHTS309-3 ＞VHTS312-2 ＞VH 天油2288 ＞VH新油23號。

膠回收試劑盒（AxyPreTM DNA Gel Extraction Kit）購于康寧生命科學有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 和植物總RNA 提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；反轉錄試劑盒（Prime-ScriptTM RT Master Mix RR036A）和載體試劑盒（pMD 19-T Simple Vector）購于大連TaKaRa 公司；普通2×TaqPCR MasterMix 酶和D2000 DNA Ladder購于北京中科瑞泰生物科技有限公司；X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）來自本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 生長錐顯微觀察 通過AxioCam MRc 5 體視顯微鏡解剖生長錐，對越冬初期的甘藍型冬油菜生長錐進行觀察拍照。參考王躍華等[19]方法制作石蠟切片，并對越冬期甘藍型冬油菜的生長錐進行顯微觀察。生長錐掃描電鏡觀察：（1）固定液稀釋：將25%的電鏡專用戊二醛溶液用pH 7.4 的磷酸緩沖液稀釋為2.5%。（2）樣品固定：用體視顯微鏡解剖出越冬期末期甘藍型冬油菜莖尖生長錐，切取莖頂端5×5 mm 大小的組織，于2.5%戊二醛固定液固定24 h。（3）漂洗：經35%、50%、70%、90%、95%和100%無水乙醇20 min 漂洗兩次。然后逐級過渡到叔丁醇中，純叔丁醇中每次漂洗10 min，最后將組織放在純叔丁醇中，4℃冰箱過夜。（4）用冰盒攜帶制備好的樣品到電鏡室進行干燥，粘樣，金屬鍍金，并掃描觀察。

1.2.2 引物設計和實時熒光定量 根據其在甘藍型油菜（Brassica napus）中的編碼序列，通過Premier 5.0 軟件設計引物（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用Premix TaqTM（SYBR Green）試劑盒和QuantStudio 5熒光定量PCR 儀進行RT-PCR 擴 增，以cDNA 為 模 板，Bnactin為 內 參基因[20]。

表1 本研究所用qPCR引物Table 1 qRT-PCR primers used in this study

1.2.3 基因表達分析 查閱文獻獲得與生長錐調控相關基因，分別是STM（Gene ID:106444191）、CUC2（Gene ID: 106390278）、NAC（Gene ID:106438092）、KNATM（Gene ID:106414665）、WUS（Gene ID: 106364211） 和CLV3（Gene ID:111198561）。以常溫處理與低溫處理的幼苗（4℃，40 d）為材料，在頂芽下1 mm部位切取2 mm3大小的生長錐組織，測定低溫處理較常溫處理生長錐的基因表達量變化。

1.2.4 基因克隆 提取甘藍型冬油菜生長錐的總RNA，采用Bio Mater5超微量紫外分光光度計測定濃度和純度，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量。利用反轉錄試劑盒進行反轉錄RNA，得到單鏈cDNA，測定濃度稀釋至50 ng·μL-1。由NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）中甘藍型油菜的編碼序列，設計BnSTM全長特異性引物（F: ATGGAAAGTGGTTCCAACAGCACTTC；R: TCAAAGCATGGTCGAGGAGATGTG），以cDNA 為模板，進行PCR擴增。擴增體系如下：2×Taq PCR MasterMix 5μL；前引物0.5μL，后引物0.5μL，模板1μL，ddH2O 3μL。擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（預期產物長度1149 bp），進行瓊脂糖凝膠回收，回收產物與pMD-19T 載體16℃連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α，通過藍白斑篩選陽性克隆送測序。

1.3 生物信息學分析

以NCBI 尋找完整開放閱讀框，DNAMAN 軟件進行序列比對分析，ProParam 軟件進行蛋白理化性質分析和氨基酸疏水性分析，利用在線軟件WoLF PSORT 進行亞細胞定位預測，TMHMM 軟件預測跨膜結構，SignalP 軟件進行信號肽預測，利用NCBIConserved Domains 預測保守結構域，SOPMA 軟件預測蛋白二級結構，采用SWISS-MODEL 預測蛋白質三級結構，ExPASy-PROSITE 預測蛋白質活性中心，以DNAMAN 軟件進行多序列比對，通過MEGA 6.06軟件進行系統進化樹分析。

1.4 綠色熒光融合蛋白表達載體構建

1.4.1 載體構建 采用Gateway?技術，去除終止密 碼 子，添 加Partial attB1/attB2 接 頭（AttB1：GGGGACAAGGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT；AttB2： GGGGACCACTTTGGTACAAGAAAGCTGGGT），將目的片段通過BP 酶反應連接到入門載體pDONR/Zeo 上，從陽性菌株中提取正確的質粒，通過LR酶反應重組到表達載體pEarley Gate103中。將該質粒轉化大腸桿菌DH5α（卡那霉素抗性，Kan），對單菌落進行PCR 鑒定并送測序，以確保目的基因序列正確。

1.4.2 農桿菌轉化 采用液氮速凍法轉化農桿菌GV3101，將含重組質粒的農桿菌通過離心收菌，接種于LB 培養基（終濃度20 μg·mL-1Rif 和50 μg·mL-1Kan），200 r·min-128℃倒置培養2～3 d。挑取單菌落進行PCR 鑒定，將陽性菌液擴大培養，用50%甘油保存在-80℃超低溫冰箱中。

1.5 亞細胞定位

通過注射法瞬時轉染本氏煙草，在LSM800（ZEISS，Germany）激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 數據處理

采用Excel 2010 和SPSS 22 統計軟件對數據進行分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 不同冬性甘藍型冬油菜品種生長錐形態觀察

通過AxioCam MRc 5 體視顯微鏡解剖觀察發現，不同冬性品種間生長錐存在較大差異，其中明顯區別于其他品種的是強冬性的VHTSG10（圖1D），生長錐表面光滑透明，體積矮小，生長錐凸起較低；而冬性弱的品種VH 新油23 號（圖1O）和VH天油2288（圖1N）等生長錐組織形成明顯的細胞凸起。

圖1 甘藍型冬油菜生長錐形態（×100倍）Fig.1 Morphology of growing points of Brassica napus(×100)

為進一步研究甘藍型冬油菜的生長錐形態，以冬性較強的VHTSG10、VHTS309-4、VHNPZ269-1、VH8(G)和冬性較弱的VH 天油2288、VH 新油23 號等品種的生長錐為試驗材料，進行石蠟切片觀察發現，不同抗寒性品種的生長錐高度明顯不同。其中強冬性性品種VHTSG10（圖2A）和VHTS309-4（圖2B）生長錐較低，分別為132.5 μm 和215.4 μm，原套表面的細胞排列緊密，細胞核較大，生長錐基部有一層排列緊密染色較深的細胞群將原體與下部細胞分開，而冬性弱的品種VH 天油2288（圖2E）和VH 新油23（圖2F）生長錐較高，分別為357.8μm 和575.6μm，原套細胞染色加深，細胞間隙較大。

圖2 甘藍型冬油菜生長錐形態差異（×10）Fig.2 Morphological difference of growth point of winter rape(B.napus)

根據石蠟切片結果，選擇強冬性VHTSG10、VHTS309-4 和弱冬性的VH 天油2288、VH 新油23號為材料，通過掃描電鏡觀察發現，強冬性材料VHTSG10 和VHTS309-4 的生長錐較低，表面平整光滑，呈半球饅頭形，高度分別為148.70 μm（圖3A）和157.39μm（圖3B），弱冬性材料VH天油2288和VH 新油23 號的生長錐較高，表面有許多幼嫩的小突起分生組織，高度分別為172.17μm（圖3C）和181.74μm（圖3D）。

圖3 甘藍型冬油菜生長錐掃描電鏡觀察Fig.3 Scanning electron microscope observation on the growth point of winter rape

2.2 甘藍型冬油菜生長錐相對高度

根據本研究前期預測定數據，觀察同一生育時期生長錐相對高度（圖4），發現弱冬性品種VH 天油2288 與強冬性品種VHTSG10 的生長錐相對高度差異顯著。

圖4 測定甘藍型冬油菜的生長錐相對高度Fig.4 Measuring the relative height of growing points in Brassica napus

分析12 個冬性不同的甘藍型冬油菜生長錐相對高度發現，隨著甘藍型冬油菜葉齡增加（圖5），生長錐高度明顯增加：三葉期不同品種間生長錐相對高度差異不顯著；五葉期VH 天油2288 的生長錐相對高度為1.05 cm，顯著高于VHTSG10 等強冬性材料（P＜0.05）；七葉期VHTSG10 的生長錐相對高度為0.90 cm，顯著低于VHTS309-3等冬性材料和VH天油2288等弱冬性材料（P＜0.05）。

圖5 不同冬性甘藍型冬油菜的生長錐的相對高度Fig.5 Relative height of growth points of winter rape with different winterness

2.3 低溫脅迫下生長錐分化調控基因的表達

相關基因的表達分析表明（圖6），低溫處理后生長錐調控相關基因均上調表達。BnSTM基因的表達量基本呈現隨品種抗寒性減弱而升高的趨勢，在生長錐較低的強抗寒材料VHTSG10 中表達量最低，上調了1.343 倍（圖6A）；BnCUC2基因的表達量基本呈現隨品種抗寒性減弱而降低的趨勢，在生長錐較低的強抗寒材料VHTSG10品種中表達量最高，上調了19.726 倍（圖6B）。BnCLV3、BnWUS、Bn-NAC、BnKNATM基因在不同品種中相對表達量無明顯規律（圖6C～F）。

圖6 調控生長錐分化相關基因響應低溫處理的表達分析Fig.6 Expression of genes related to regulating growth point differentiation in response to low temperature treatment

分析不同葉齡調控生長錐分化基因的表達模式發現，隨著苗齡增加，BnSTM和BnCUC2基因的表達量變化呈先升高后下降趨勢，且在五葉期的表達量均顯著高于三葉期和七葉期（P＜0.05）（圖7）。BnSTM基因的表達量變化幅度在強抗寒材料VHTSG10中最小，五葉期和七葉期較三葉期分別增加0.367倍和0.035倍（圖7A）；BnCUC2基因的表達量的變化幅度在強抗寒材料VHTSG10中最小，五葉期較三葉期增加0.118 倍，七葉期較三葉期下降0.197倍（圖7B）。

圖7 不同葉齡調控生長錐分化相關基因的表達分析Fig.7 Expression analysis of genes related to growth point differentiation regulated by different leaf age

對12個甘藍型冬油菜材料的抗寒性、生長錐相對高度與生長錐調控相關基因相對表達量三者的相關性分析發現（表1）：BnSTM基因表達量與半致死溫度（LT50）和不同葉齡的生長錐相對高度存在中強正相關關系。BnCUC2基因表達趨勢與BnSTM基因相反，與LT50和生長錐相對高度存在緊密負相關關系，|r|均大于0.672**。LT50與生長錐相對高度相關性分析表明，LT50與生長錐相對高度存在很強的正相關性，r最高達0.99**。

表1 調控生長錐分化相關基因表達的相關性分析Table 1 Correlation analysis of regulating the expression of genes related to growth point differentiation

2.4 生長錐分化調控關鍵基因的克隆

根據本研究數據，BnSTM和BnCUC2與生長錐高度的相關性較高，可以認為這2 個基因是生長錐分化調控的關鍵基因，因BnCUC2基因的CDs 序列與前人研究結果一致，本研究不再重新克隆[17]。從NCBI 中查找甘藍型油菜（B.napus）STM的CDs 序列，以抗寒品種VHTSG10 與弱抗寒品種VH 天油2288 的生長錐cDNA 為模板，根據編碼序列設計特異性引物進行PCR 擴增（見1.2.4），克隆到一條長度為1149 bp 的單一條帶，擴增產物經凝膠電泳回收、大腸桿菌轉化、藍白斑篩選和菌落PCR，將陽性克隆的菌液送測序。

通過NCBI 尋找開放閱讀框發現，VHTSG10 和VH 天油2288 的BnSTM基因含有完整ORF，長度為1149 bp。蛋白理化性質分析表明，VHTSG10 的BnSTM 蛋白由382 個氨基酸組成，屬于不穩定親水性蛋白（圖8A）。亞細胞定位預測表明BnSTM 蛋白定位于細胞核中，存在2 個跨膜結構域（圖8B），無信號肽（圖8C），存在KNOX1、KNOX2、ELK 和Homeobox_KN 四個結構域（圖8D）。二級結構預測顯示，BnSTM 蛋白的二級結構中α-螺旋占37.17%，β-折疊占4.45%，無規卷曲占51.05%，延伸鏈占7.33%（圖8E）。采用SWISS-MODEL 在線軟件預測BnSTM 蛋白的三級結構，模型覆蓋度為44.76%（圖8F）。存在ELK、HOMEOBOX_2 和HOMEOBOX_1等3個活性中心（圖8G）。

圖8 甘藍型冬油菜VHTSG10 的STM蛋白生物信息學分析Fig.8 Bioinformatics analysis of STM protein in VHTSG10

將強冬性材料VHTSG10 中克隆到的STM 蛋白序列與VH 天油2288、基因庫的甘藍型油菜（B.napus）（NM_001316059）、甘藍（B.oleracea）、白菜型油菜（B.rapa）、蘿卜（Raphanus sativus）等11 個材料的STM 蛋白序列進行親緣關系比對，結果表明（圖9），VHTSG10 與VH 天油2288、甘藍型油菜、甘藍和白菜型油菜的親緣關系較近。通過多序列比對發現，VHTSG10 與VH 天油2288 中STM基因編碼的蛋白質相似性達99.74%，與甘藍型油菜和白菜型油菜中STM基因編碼的蛋白質相似性均達到98.69%，與蘿卜和甘藍中的STM基因編碼的蛋白質相似性分別達到97.12%和92.67%，而與乳漿草（Euphorbia esula）的序列同源性僅為53.66%。

圖9 甘藍型冬油菜VHTSG10中的STM蛋白氨基酸序列比對系統進化樹分析Fig.9 Sequence alignment of amino acids and phylogenetic analysis of STM proteins sequence in VHTSG10

2.5 亞細胞定位分析

將VHTSG10 的BnSTM 融合綠色熒光蛋白GFP，成功構建表達載體pEarley Gate103-BnSTMGFP，轉化農桿菌GV3101，并通過注射法瞬時轉染煙草，利用激光共聚焦顯微鏡對BnSTM 蛋白進行亞細胞定位觀察。結果表明，35S∶GFP 的綠色熒光蛋白廣泛分布在質膜上，而35S∶BnSTM-GFP 綠色熒光蛋白主要分布在細胞核中，與預測結果一致（圖10）。

圖10 BnSTM 蛋白的亞細胞定位Fig.10 Subcellular localization of BnSTM

3 討論與結論

較春性、半冬性、冬性甘藍型冬油菜而言，強冬性甘藍型冬油菜需要通過低溫春化才能進入生殖生長，而感受低溫的主要部位是生長錐[21]。甘藍型冬油菜生長錐凸起較高、下胚軸較長，會使生長錐在冬季裸露于地表，容易受干旱、低溫等逆境影響[22]，故甘藍型冬油菜較白菜型冬油菜抗寒性弱，與其生長錐與下胚軸特性是有關的。本研究發現，冬性強弱不同的甘藍型冬油菜品種生長錐高度具有明顯差異，強冬性的抗寒品種的生長錐相對高度較低，避免裸露于地表或裸露在地表的體積較小，受低溫損傷也就較輕，利于規避北方冬季凍害，而冬性較弱的品種生長錐高度較高，不利于規避凍害。研究表明，生長錐高低與其分化相關，生長錐分化要經歷一系列生理生化過程，在連續的生長錐分化過程中[23]，隨著低溫下生長錐及相關器官的分化，生長錐內的淀粉物質越來越多[24]，營養物質大量消耗，細胞濃度下降，易造成細胞結冰受凍致死[4]。強冬性材料生長錐較弱冬性材料低，這可能與春化階段生長錐分化遲緩，營養物質消耗較少，細胞濃度較高有關[2]。冬小麥研究也表明，冬小麥耐低溫能力不同主要與生長錐的分化程度有關，抗寒性弱的品種生長錐伸長較早[25]。半致死溫度（LT50）是目前廣泛用于植物抗寒性評價的常用指標[26]，本研究證實冬性強弱不同的品種間LT50具有顯著差異，強冬性的VHTSG10等品種LT50明顯低于弱冬性的VH 新油23 號與VH 天油2288，且生長錐高度與LT50存在正相關關系。以LT50為評價指標評價的參試材料抗寒性由強到弱的位次與參試材料的感溫性由強到弱的特性一致，表明北方甘藍型冬油菜的生長錐高度與抗寒性是密切相關的，可用于判定抗寒性弱強。

擬南芥頂端分生組織生長發育過程研究發現，CUC2與STM基因共同調控其頂端分生組織的形成，STM是CUC2的下游基因[25]，CUC2受STM的調控[27]。本研究發現，BnSTM基因、BnCUC2基因的表達與抗寒性和生長錐相對高度相關性顯著，低溫引起基因上調表達，但生長錐高度較低的強抗寒材料，BnSTM基因表達量較低，BnCUC2基因表達量較高，與前期研究結果一致[17]。VHTSG10 中BnSTM基因在細胞核表達，編碼蛋白序列存在KNOX1、KNOX2、ELK 和Homeobox_KN 四個結構域，BnSTM蛋白在調控生長錐分化時存在的差異，可能與堿基突變引起的編碼氨基酸發生改變有關。但STM 蛋白序列在VHTSG10和白菜型油菜、甘藍和蘿卜中相似性很高，說明STM 蛋白對生長錐分化的調控作用在不同物種間功能保守。

北方甘藍型冬油菜的生長錐高度與抗寒性是密切相關的，是判定抗寒性弱強的重要性狀。STM基因響應低溫脅迫在細胞核上調表達，表達量與強冬性甘藍型油菜的苗期生長錐高度和LT50存在正相關關系，與抗寒性存在負相關關系，STM 蛋白在白菜型油菜、甘藍和蘿卜等物種間功能保守，是調控生長錐分化的關鍵基因。