BnPHR1轉基因油菜低溫抗性機制探究

伍小琴，王有藝，童奕凱，張建豐，顧斌潔，徐帆，任峰

（華中師范大學生命科學學院，湖北 武漢，430079）

低磷是作物生長發育的限制因素，也是農業生產面臨的主要問題之一。無論是自然環境下還是農業生產中，植物經常處于磷素缺乏的狀態。為了應對低磷脅迫，植物進化出一系列反應來維持自身的正常生長。這些反應很大程度上通過轉錄水平進行調控。擬南芥與油菜中包括多數轉錄因子在內的一批基因都受低磷的調控，表明植物對低磷的適應是基因組中大批基因受協調性誘導或抑制的系統性過程[1～3]。

磷（phosphorus，P）是植物生長所需大量必需元素之一。P 在植物中具有多種功能，包括能量產生、核酸合成（DNA、RNA）、光合作用、糖酵解作用、呼吸作用、細胞膜形成、磷酸化和去磷酸化反應、氧化還原反應、信號轉導、碳水化合物代謝及氮固定等[1]。植物所利用的磷主要來源于土壤，其主要吸收形式是無機磷酸鹽（phosphate,Pi）[2]。土壤溶液中無機磷酸鹽含量大約在1～10μmol/L 之間，但多數以植物不能吸收利用的形式存在[2,3]。因此，磷營養缺乏是作物生長發育的限制因素。

植物在發育及生化上都演化出對低磷環境的適應。MYB家族成員PHR1是擬南芥磷饑餓應答中的關鍵轉錄激活因子[4]。擬南芥phr1突變體磷含量降低[4,5]。相反，過量表達PHR1導致擬南芥地上部分磷含量的升高以及磷饑餓應答基因表達上調[5]。在油菜、水稻和菜豆中也發現了PHR1的同源基因[6～8]。PHR1 通過與目標基因啟動子中的順式元件P1BS（GNATATNC）的結合來調控下游靶基因[4]。在油菜中，BnPHR1 能夠通過正調控高親和磷轉運蛋白基因BnPht1;4來促進油菜磷的吸收，過量表達BnPHR1能夠影響油菜低磷脅迫適應及生長發育[8]。

而低溫是影響植物生長發育的另一種非生物脅迫因素。0℃以上的低溫脅迫會減少植物的光合作用，降低細胞膜的流動性及基礎代謝等過程，抑制植物的生長發育。0℃以下的低溫脅迫會使植物細胞內和細胞間結冰，造成直接的機械損傷，嚴重時導致植物死亡[9]。低溫脅迫造成了一系列生理和代謝物的變化，比如活性氧酶系（reactive oxygen species, ROS），丙二醛（malondialdehyde, MDA），蔗糖（sucrose），脂質過氧化物（lipid peroxides），脯氨酸（proline），及其他代謝物的改變。目前，在擬南芥中ICE1-CBF-COR 低溫脅迫調控通路已比較清晰。低溫脅迫時，COR（cold-regulated）基因家族基因大量表達，這些基因包括編碼抗凍蛋白基因及低分子量抗凍保護劑生物合成基因[10,11]。在擬南芥ICE1-CBF-COR 低溫調控通路中最為關鍵的組分是CBF（C-repeat binding factor）。擬南芥中與低溫脅迫相關 的CBF基 因，分 別 為CBF1、CBF2和CBF3[12]。CBF屬于AP2/ERF 轉錄因子家族，通過識別并結合下游基因啟動子中的CRT/DRE 順式作用元件（A/GCCGAC）并激活其轉錄活性來增加抗寒性。CBF基因過表達可以顯著提高擬南芥抗凍能力[13]。

已有研究表明茉莉酸（jasmonic acid，JA）信號參與植物低磷脅迫應答。在擬南芥中低磷脅迫能誘導JA 合成并能增強其對草食昆蟲防御能力[14]。而低溫脅迫中ICE1活性與JA 信號直接有關。JA 信號通路中的抑制因子JAZ（JAZMONATE ZIM-DOMAIN）蛋白能夠與ICE1 互作并抑制ICE1 活性[15]。擬南芥中SIZ1基因編碼一種類泛素化修飾（sumoylation，SUMO）E3 連接酶。PHR1 作為SUMO 類泛素化修飾靶標而被SIZ1 修飾。SIZ1 功能缺失突變可導致擬南芥持續性磷饑餓反應，如磷饑餓應答基因表達上調[16]。在低溫脅迫中CBF蛋白水平也存在SUMO 類泛素化修飾調控，ICE1 蛋白也作為SUMO 類泛素化靶標而被SIZ1 修飾[17]。油菜中低溫應答基因BnCOR25不僅參與油菜低溫脅迫應答，同時BnCOR25在油菜低磷脅迫中也受到明顯誘導[18,19]。此外，植物低磷及低溫脅迫中還存在生理生化適應的相關性，如植物低磷脅迫典型表型特征之一為地上部分花青素積累[20]，而植物低溫脅迫也會導致植物地上部分花青素積累[21]?；蛘{控及生理生化適應的相關性表明植物低磷和低溫應答調控網絡存在密切的關聯。

本文發現油菜BnPHR1參與了油菜低溫脅迫應答，其過量表達轉基因油菜株系低溫抗性提高，一些低溫相關基因也可能受到BnPHR1 直接或間接調控。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用油菜為甘藍型油菜（Brassica napusL，Westar）。BnPHR1過表達（35S:BnPHR1）轉基因油菜株系由本實驗室提供。將WT（野生型）和35S:Bn-PHR1轉基因油菜種子表面消毒后，平鋪于1/2 MS培養基，23℃培養箱中萌發。萌發的油菜幼苗移入土缽后于溫室（16 h 光照/8 h 黑暗，濕度65%）培養生長。生長發育3 周大小的油菜移入低溫（-4℃）光照培養箱處理24 h，再移入23°C恢復生長。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取、cDNA 合成及qRT-PCR 取油菜葉片，液氮研磨后加1 mL RNAiso Plus（TaKa-Ra）試劑，靜置5 min，4℃，12 000 r/min 離心10 min；取上清，加入200 μL 氯仿，劇烈振蕩30 s，4℃，12 000 r/min 離心15 min；取上清，加入600 μL 異丙醇混勻，靜置5 min，4℃，12 000 r/min離心10 min；去上清，晾干后加1 mL 70 %乙醇，4℃，12 000 r/min，離心5 min；去上清，晾干后加30 μL DEPC 水溶解RNA?？俁NA 經DNase 酶消化去除DNA。依據SMART MMLV 反轉錄酶（TaKaRa）說明書合成第一鏈cDNA。根據基因特異性引物，參考Takara 公司的SYBR System 操作手冊進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）擴增。以BnACTIN2基因為內參。根據得到的Ct值，計算目標基因在不同處理下的相對表達量。

1.2.2 MDA 含量測定 稱取0.25 g 油菜葉片，液氮處理后用預冷的研缽磨，然后加入4 mL預冷磷酸緩沖液（150 mmol/L，pH 7.0）勻漿，然后轉入10 mL離心管中在4℃，12 000 r/min 離心20 min，轉移上清液至新的試管中用于MDA測定。

1.2.3 電導率測定 取葉片0.2 g，剪成1 cm 大小置于25 mL ddH2O 浸泡，搖床上150 r/min 振蕩24 h，使用雷磁DDSJ-318 電導率儀測得起始電導率值Ci，然后于滅菌鍋121℃下滅菌20 min，取出冷卻至室溫時測得最大電導率。

1.2.4 轉錄組數據分析 WT、35S:BnPHR1轉基因油菜幼苗高磷（1 mmol/L KH2PO4）和低磷（1 μmol/L KH2PO4）營養處理7 d，分別取地上部分（葉片）和根組織進行轉錄組分析，每個樣品設置兩個生物學重復，共計16個測序樣品。RNA提取及測序工作由百邁客公司完成，利用Illumina 測序技術進行測序，原始測序數據NCBI 注冊號為PRJNA739537。通過對轉錄組數據質控處理，分析所選差異基因|Fold Change|≥1.5。利用軟件TBTOOLS 和Blast進行同源分析，查找出與低溫脅迫相關差異基因。取差異基因起始密碼子（ATG）上游2 kb 序列并通過plant pan網站（http://plantpan. itps. ncku. edu. tw/promoter.php）進行啟動子元件分析。利用軟件TBTOOLS 對啟動子進行可視化作圖。

2 結果與分析

2.1 BnPHR1過量表達轉基因油菜表達鑒定

實驗室前期工作獲得了多個35S:BnPHR1轉基因油菜株系。選取6 個T3代株系（L1、L10、L12、L31、L32、L33）進行BnPHR1基因表達量分析。提取35S:BnPHR1轉基因油菜株系總RNA，逆轉錄成cDNA，利用特異性引物，通過qRT-PCR 分析BnPHR1表達量。結果顯示，6 個35S:BnPHR1轉基因油菜株系中BnPHR1表達量相比野生型（WT）均有不同程度的提高，其中L12，L32 兩個株系BnPHR1表達量相對較高（圖1）。選擇L12 和L32 兩個株系用于后續低溫處理分析。

圖1 轉基因油菜BnPHR1表達分析Fig.1 Expression of BnPHR1 in transgenic Brassica napus

2.2 BnPHR1過量表達轉基因油菜低溫表型分析

WT 和35S:BnPHR1轉基因油菜（L12，L32）低溫處理24 h 后，發現兩個轉基因油菜株系相比WT 油菜葉片萎焉程度明顯減輕，表明BnPHR1基因過表達增加了轉基因油菜低溫抗性（圖2A）。植物在逆境中細胞膜受損，膜內電解質外滲，細胞浸提液電導率增大。逆境下也會發生質膜過氧化作用，丙二醛是質膜過氧化作用的最終產物，它的含量可以反映植物遭受逆境的程度。低溫脅迫條件下35S:Bn-PHR1轉基因油菜L12 和L32 兩株系葉片電導率相比WT 明顯減弱（圖2B），葉片丙二醛含量相比WT也顯著降低（圖2C）。結果顯示，低溫脅迫條件下L12 和L32 轉基因株系相比WT 細胞膜損傷程度降低。

圖2 BnPHR1轉基因油菜表型分析Fig.2 Phenotypic analysis of BnPHR1 transgenic B.napus

2.3 35S:BnPHR1 轉基因油菜地上部分低溫應答基因表達分析

為了探究轉基因油菜中BnPHR1過量表達對低溫應答基因影響，將高磷和低磷處理后的野生型（WT）與35S:BnPHR1轉基因油菜（L12）地上部分（葉）和根組織取樣進行轉錄組測序，測序結果顯示每個樣品Clean Data 都達到了6.76 Gb，Q30 堿基的百分比在89.47%及以上。將各樣品Clean Reads 與甘藍型油菜基因組序列進行比對，比對出來測序效率在68.52%到77.06%之間（表1）。

表1 RNA-Seq clean reads與甘藍型油菜基因組比對效率Table 1 RNA-seq clean reads comparison efficiency with B.napus genome

從差異表達基因中篩選低溫脅迫相關基因。通過查閱文獻及擬南芥冷脅迫相關基因同源比對從地上部分差異表達基因中篩選出44 個冷脅迫相關基因，其中包含低溫信號調控通路因子基因如BnCOR15B，BnCOR78，BnCBF2等（表2）。根據轉錄組數據FPKM 值繪制聚類熱圖（圖3）。各組別具體FPKM 值及組別差異倍數見附件1（首頁OSID 碼）。BnPHR1 作為轉錄因子可結合靶基因啟動子P1BS元件并正調控其表達。對地上部分與冷相關基因進行啟動子元件分析，發現28個基因啟動子中含有P1BS 元件，對這些基因啟動子進行了可視化分析（圖4）。

圖4 油菜地上部分BnPHR1調控冷脅迫相關基因啟動子可視化分析Fig.4 Visual analysis of promoters of cold-stress-related genes in shoot of B.napus

表2 油菜地上部分受BnPHR1影響的冷脅迫相關基因Table 2 Cold-stress-related genes affected by BnPHR1 in shoot of B.napus

圖3 油菜地上部分BnPHR1影響冷脅迫相關基因聚類熱圖Fig.3 Heat map of the cold-stress-related genes affected by BnPHR1 in shoot of B.napus

挑選了部分差異基因進行表達驗證。qRTPCR 結果顯示在低磷條件下，轉基因油菜地上部分BnCBF2、BnCOR15B及BnCOR78表 達 顯 著 上 調，BnAZF1、BnESK1及BnSAUR14表達顯著下調，該結果與轉錄組數據一致（圖5）。

圖5 油菜地上部分BnPHR1調控冷脅迫相關基因qRT-PCR分析Fig.5 qRT-PCR of BnPHR1 regulated cold-stress-related genes in shoot of B.napus

2.4 35S:BnPHR1 轉基因油菜根中低溫應答基因表達分析

為了探究轉基因油菜根中BnPHR1對低溫應答基因的影響，將WT 與35S:BnPHR1轉基因油菜（L12）根組織取樣進行轉錄組測序。從差異表達基因中篩選低溫脅迫相關基因。通過查閱文獻及擬南芥冷脅迫相關基因同源比對分析從地下部分根差異表達基因中篩選出49 個冷脅迫相關基因（表3）。根據轉錄組數據FPKM 值繪制聚類熱圖（圖6），各組別具體FPKM 值及組別差異倍數見附件2（首頁OSID 碼）。BnPHR1 作為轉錄因子可結合靶基因啟動子P1BS 元件并正調控其表達。對地下部分與冷相關基因進行啟動子元件分析，發現26個基因啟動子中含有P1BS元件，對這些基因啟動子進行了可視化分析（圖7）。

圖6 油菜根中BnPHR1影響冷脅迫相關基因聚類熱圖Fig.6 Heat map of cold-stress-related genes affected by BnPHR1 in root of B.napus

圖7 油菜根中BnPHR1調控冷脅迫相關基因啟動子可視化分析Fig.7 Visual analysis of promoters of cold-stress-related genes in root of B.napus

表3 油菜根中受BnPHR1影響的冷脅迫相關基因Table 3 Cold-stress-related genes affected by BnPHR1 in root of B.napus

續表

3 討論與結論

油菜低磷脅迫應答與低溫脅迫應答調控之間的關聯及互作機制目前是油菜研究的空白領域。但從現有的研究數據中可以找到很多低磷脅迫與低溫脅迫相關聯的線索。擬南芥中，許多在Pi 饑餓脅迫時表達上調的基因，包括Pht1;1、Pht1;4、MIR399、IPS1和RNS1等基因，其啟動子區域都共有P1BS 基序。在低磷脅迫條件下，這些基因作為PHR1直接靶基因而被激活[4,19]。在油菜中，BnPHR1能夠通過正調控高親和磷轉運蛋白基因BnPht1;4來促進油菜磷的吸收，過量表達BnPHR1 能夠影響油菜低磷脅迫適應及生長發育[8]。

ICE1 蛋白作為SUMO 類泛素化靶標而被SIZ1修飾，SIZ1功能缺失突變體表現低溫敏感的表型[22]。油菜低溫應答基因BnCOR25不僅參與油菜低溫脅迫應答，同時在油菜低磷脅迫中也受到明顯誘導[18]。在BnPHR1過量表達轉基因油菜低溫處理表型分析發現BnPHR1 能提高植株抗冷性，35S:BnPHR1轉基因油菜具有比對照更高的耐低溫特性。轉基因油菜轉錄組數據挖掘發現，BnPHR1 影響冷相關基因表達。在油菜地上部分和根中分別鑒定到44 個和49 個差異基因受到BnPHR1 調控。這些受BnPHR1調控的基因中包含一些經典的低溫脅迫調控通路成員，如BnCOR15B，BnCOR78，BnCBF2等?；騿幼釉治霭l現轉基因油菜中有部分差異啟動子中含有P1BS 元件。BnPHR1 可能與這些啟動子結合調控這些基因轉錄，增強植株對冷的抵抗力，提高耐寒性。植物低磷及低溫脅迫中還存在生理生化適應的相關性，如植物低磷脅迫典型表型特征之一為地上部分花青素積累（葉片呈現紫紅色），而植物低溫脅迫也會導致植物地上部分花青素積累。因此推測BnPHR1作為低磷應答核心調控因子可能在油菜低磷脅迫與低溫脅迫應答之間起到聯結者和協調者的作用。BnPHR1 可能在多種生物、非生物脅迫中扮演重要調控角色。依據BnPHR1在油菜低磷、低溫脅迫應答中的雙功能角色指導耐低磷、耐低溫雙功能油菜品種選育具有潛在的應用前景。