不同中藥復方及不同提取方法提取液對小鼠耐缺氧作用的影響*

李婉玉，馬慧萍，馬趣環，石曉峰△，魯艷梅，張朋朋，張家旭，董學鳳，葉倩女

（1.甘肅中醫藥大學，蘭州 730030；2.甘肅省醫學科學研究院，蘭州 730050；3.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院全軍高原損傷防治重點實驗室，甘肅 蘭州 730050）

人體各器官對于氧氣都有不同程度的需求，尤其以大腦和心臟耗氧量最多；當氧氣吸收障礙或轉化不足會引起一系列慢性疾?。?］，故有缺氧乃萬病之源之說；進駐高原低氧環境或密閉空間作業的人員，以及患有心肺等疾病者，常處于缺氧狀態，導致身體亞健康現象。為了提高人們的生活質量，開發提高缺氧耐受力的藥物及保健食品，已成為研究關注的又一熱點［2］。

復方紅景天全方由可用于保健食品的紅景天、黃芪和藥食同源的黃精、枸杞子（別名：紅耳墜）4味中藥組成，方中各藥均單獨具有耐缺氧、抗疲勞活性［3-6］，其中紅景天、枸杞子、黃芪是純中藥類和中藥與營養素復方類提高缺氧耐受力保健食品中使用頻次較高（前10位）的中藥［2］。本課題組前期曾根據處方中各味藥材的有效成分和化學性質，設計出紅景天和黃芪先醇提，藥渣與黃精、枸杞子2味藥材進行水提的工藝，并用Box-Behnken響應面法［7］和多目標遺傳算法［8］對其醇提、水提工藝進行優選，但是缺乏藥效學驗證的工藝好似無本之木，且紅景天資源匱乏，現已不支持大規模的開發利用［9］，而黃芪、黃精和枸杞子資源豐富，質量優良，作為西北高原道地藥材具有很大的開發潛力。為此，本實驗設計以紅景天或黃芪為主成分組成的不同中藥復方，并用不同的提取方法制得提取液，評價不同中藥組方及不同提取方法提取物對小鼠的耐缺氧作用，旨在優選中藥組方及提取方法，為臨床應用提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

紅景天購自于隴南市惠康中藥材有限公司，黃芪、黃精、枸杞子藥材均購自蘭州安寧杏林藥材批發部，經甘肅省醫學科學研究院石曉峰主任藥師鑒定為正品。復方丹參滴丸（規格：27 mg×180丸，批號：190709）由天士力醫藥集團股份有限公司生產，BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：20201010）由北京索萊寶科技有限公司生產；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（批號：20201211）、超氧化物歧酶（SOD）試劑盒（批號：20201212）、谷胱甘肽（GSH）試劑盒（批號：20200930）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（批號：20200818）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號：20200831）均由南京建成生物工程研究所生產。

1.2 動物

SPF級雄性BALB/c小鼠180只，體重20～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號SCXK（京）2016-0006。動物飼養于中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院動物實驗中心，使用許可證號：SYCK（軍）2020-0040。飼養室溫度恒定在25～27℃，每12 h明暗交替，實驗動物維持正常的飼料喂養，適應性飼養3 d后開始實驗，實驗期間實驗動物自由攝食進水。

1.3 儀器

YC-010型多功能提取濃縮回收機組，上海雅程儀器設備有限公司；HH-4型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；DGZ-76型電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；CX-100快速開蓋萬能高速粉碎機，上海市晟喜制藥機械有限公司；AE200型電子分析天平；全自動樣品快速研磨儀JXFSTPRP-24，上海凈信科技；Sigma 3K15低溫離心機，德國Sigma凈信公司；SpectraMax i3全自動熒光酶標儀，Molecular Devices公司。

1.4 實驗組藥物的制備

復方紅景天醇-水提取組：依處方比例分別稱取4味藥材，將紅景天和黃芪混合，加入14倍藥材量的70%乙醇，回流提取138 min，同法提取2次［7］，過濾，濾液減壓回收至無醇味；藥渣與黃精、枸杞子共同水提，按料液比1∶10（g：ml）加水提取2.94 h，同法3次［8］，過濾，濾液與無醇味的醇提物合并，濃縮，浸膏于50℃烘干，得浸膏粉373.56 g，備用。

復方黃芪醇-水提取組：按上述方法和工藝條件操作，將黃芪先醇提，藥渣與黃精、枸杞子混合共同水提，制得浸膏粉210.17 g，備用。

復方紅景天水提取組：依處方比例分別稱取4味藥材，混合，按料液比1∶10（g：ml）加水提取2.94 h，同法提取三次［8］，過濾，合并濾液，濃縮，浸膏于50℃烘干，得浸膏粉323.14 g，備用。

復方黃芪水提取組：按上述方法和工藝條件操作，將黃芪、黃精、枸杞子混合共同水提，得浸膏粉188.31 g，備用。

給藥前將各組浸膏粉按相應劑量用滅菌注射用水配制成溶液，備用。

1.5 分組及給藥

將180只BALB/c小鼠隨機分成6組（n=30），即空白對照組、復方丹參組、復方紅景天醇-水提取組、復方紅景天水提取組、復方黃芪醇-水提取組、復方黃芪水提取組。其中，空白組灌胃滅菌注射用水，復方丹參組給藥劑量依人用劑量折算為0.15 g/kg；復方紅景天醇-水提取組和水提取組給藥劑量為3 g/kg；復方黃芪醇-水提取組和水提取組給藥劑量為1.7 g/kg（復方紅景天醇-水提取組和水提取組給藥劑量依預實驗確定；復方黃芪醇-水提取組和水提取組根據處方的比例和復方紅景天醇-水提取組和水提取組給藥劑量折算，以保持除紅景天外的其余3味藥的等量）；各組連續灌胃給藥10 d，0.2 ml/10 g，每日一次，實驗遵守相關倫理要求。

1.6 常壓耐缺氧實驗

各組小鼠于末次灌胃1 h后［10］，將小鼠放入裝有5 g鈉石灰的250 ml磨口瓶中，每瓶放一只。瓶底預先放一張濾紙用于吸收小鼠排泄物，預先在瓶口內部和瓶蓋外沿均勻涂抹凡士林，放入小鼠后立即塞緊瓶蓋（防止漏氣）并開始計時，觀察到小鼠呼吸停止，腹部不起伏終止計時，記錄每只小鼠的存活時間，并計算存活時間延長率，延長率%=各給藥組（死亡時間-開始時間）/空白組存活時間×100%。

1.7 亞硝酸鈉中毒存活實驗

各組小鼠于末次灌胃1 h后，腹腔注射濃度為24 mg/ml的亞硝酸鈉溶液，注射劑量0.1 ml/10 g，注射完成后立即開始計時，觀察到小鼠呼吸停止、無明顯活動特征終止計時，記錄每只小鼠的存活時間。

1.8 急性腦缺血缺氧實驗

各組小鼠于末次灌胃1 h后，用鋒利的手術剪自頸部逐只將小鼠斷頭，記錄斷頭后小鼠張口喘氣的次數；并取小鼠的腦組織，按照試劑盒說明書測定各組小鼠腦組織中T-AOC、SOD、GSH、CAT、MDA含量。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 不同中藥復方及不同提取方法提取液對小鼠常壓耐缺氧存活時間影響的比較

與空白對照組相比，復方丹參組、復方黃芪醇-水提取組和水提取組均能顯著延長小鼠常壓耐缺氧存活時間（P＜0.01，P＜0.05），復方黃芪水提取組存活時間延長率（32.65%）優于陽性對照藥復方丹參組（21.22%），與復方丹參組相比各組耐缺氧存活時間無明顯延長；與復方紅景天醇-水提取組相比，復方黃芪水提取組存活時間顯著延長（P＜0.01）；與復方紅景天水提取組相比，復方黃芪水提取組存活時間顯著延長（P＜0.01），其余各組均沒有統計學差異；與復方黃芪醇-水提取組相比，復方黃芪水提取組存活時間顯著延長（P＜0.01，表1）。

Tab.1 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the survival time of mice under normobaric hypoxia（±s，n=30）

Tab.1 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the survival time of mice under normobaric hypoxia（±s，n=30）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the blank control group；△△P＜0.01 vs Compound Rhodiola alcohol-water extract group；▲▲P＜0.01 vs Compound Rhodiola water extract group；○○P＜0.01 vs Compound Astragalus alcohol-water extract group

Group Extration method Dose（g/kg） Survival time（min） Extension rate（%）Control - 28.65±1.32 -Compound Danshen 0.15 34.73±3.34** 21.22 Compound Rhodiola alcohol-water 3 30.51±1.41 6.49 Compound Rhodiola water 3 29.88±2.96 4.29 Compound Astragalus alcohol-water 1.7 31.55±2.97* 10.13 Compound Astragalus water 1.7 38.00±2.12**△△▲▲○○ 32.65

2.2 不同中藥復方及不同提取方法提取液對小鼠亞硝酸鈉中毒存活時間影響的比較

與空白對照組和陽性對照復方丹參組相比，不同中藥復方及不同提取方法提取液對小鼠亞硝酸鈉中毒存活時間無明顯延長，無統計學差異，各組間相互比較也無統計學差異（表2）。

Tab.2 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the survival time of mice poisoned by sodium nitrite（±s，n=30）

Tab.2 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the survival time of mice poisoned by sodium nitrite（±s，n=30）

Group Extration method Dose（g/kg）Survival time（min）Control - 17.50±1.35 Compound Danshen 0.15 17.54±1.07 Compound Rhodiola alcohol-water 3 18.15±1.85 Compound Rhodiola water 3 18.60±1.59 Compound Astragalus alcohol-water 1.7 17.76±1.73 Compound Astragalus water 1.7 19.80±3.10

2.3 不同中藥復方及不同提取方法提取液對小鼠急性腦缺血缺氧張口喘氣次數影響的比較

與空白對照組相比，復方丹參組、復方紅景天醇-水提取組、復方黃芪醇-水提取組及水提取組小鼠斷頭后張口喘氣次數均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），但與陽性對照復方丹參組相比無統計學差異；與復方紅景天醇-水提取組相比，復方紅景天水提取組、復方黃芪醇-水提取組和水提取組均無統計學差異；與復方紅景天水提取組相比，復方黃芪醇-水提取組結果無統計學差異，復方黃芪水提取組顯著增加（P＜0.05）；與復方黃芪醇-水提取組相比，各組小鼠張口喘氣次數均無明顯增加（表3）。

Tab.3 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the number of openmouth gasping in acute cerebral ischemic and hypoxic mice（±s，n=30）

Tab.3 Effects of different herbal compound and extracts of different extraction methods on the number of openmouth gasping in acute cerebral ischemic and hypoxic mice（±s，n=30）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the blank control group；▲P＜0.05 vs Compound Rhodiola water extract group

Group Extration method Dose（g/kg）Number of openmouth gasps Control - 9.29±0.95 Compound Danshen 0.15 12.57±1.13*Compound Rhodiola alcohol-water 3 12.43±0.79*Compound Rhodiola water 3 10.57±0.79 Compound Astragalus alcohol-water 1.7 12.86±1.77*Compound Astragalus water 1.7 13.57±0.54**▲

2.4 不同中藥復方及不同提取方法提取液對小鼠腦組織T-AOC、SOD、GSH、CAT、MDA影響的比較

與空白對照組相比，復方丹參組和復方黃芪水提取組T-AOC活性均顯著增強（P＜0.01，P＜0.05）；復方紅景天醇-水提取組和復方黃芪水提取組SOD活性均顯著增強（P＜0.05，P＜0.01）；復方丹參、復方紅景天醇-水提取組及水提取組、復方黃芪水提取組GSH活性均顯著增強（P＜0.01）；復方黃芪水提取組CAT活性顯著增強（P＜0.01），MDA含量顯著降低（P＜0.01）。與陽性對照復方丹參組相比，各組T-AOC活性無明顯增強，復方黃芪水提取組SOD、GSH、CAT活性均顯著增強（P＜0.01，P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。與復方紅景天醇-水提取組相比，復方紅景天水提取組、復方黃芪醇-水提取組和水提取組T-AOC活性均無明顯增強；復方黃芪水提取組SOD活性顯著增強（P＜0.05）；各組GSH、CAT活性均無顯著增強，MDA含量無明顯降低。與復方紅景天水提取組相比，復方黃芪水提取組SOD活性均顯著增強（P＜0.05），各組T-AOC、GSH、CAT活性均無明顯增強，MDA含量無顯著降低。與復方黃芪醇-水提取組相比，各組T-AOC活性均無明顯增強，復方黃芪水提取組SOD、GSH活性均顯著增強（P＜0.01，P＜0.05），CAT活性無明顯增強，MDA含量顯著降低（P＜0.05，表4）。

3 討論

復方紅景天全方由紅景天、黃芪、黃精、枸杞子4味中藥組成，是在民間驗方的基礎上經我省知名中醫學者加減論證得來。其中藥典收錄的大花紅景天Rhodiola crenulata（HK.f.et.Thoms）H.Ohba為景天科紅景天屬多年生草本植物，具有益氣活血、通脈平喘的功效［11］?，F代藥理研究表明，其具有改善睡眠、生血活血、抗腦缺氧、抗疲勞、活血止血、清肺止咳、化淤消腫、解熱退燒、滋補元氣等多方面藥理功能［4，12］，復方中黃芪為補氣要藥，配伍黃精、枸杞子補氣養陰，滋陰潤肺。中醫認為缺氧屬肺腎氣虛、痰濁瘀阻，而復方紅景天有益氣滋陰的功效，因此可針對其開發耐缺氧保健品［2］。紅景天歷來為抗缺氧常用中藥，是多種藏成藥、中成藥、食品、飲料和化妝品的重要原料，需求量大，但藥材來源以野生資源為主，由于其生境獨特、習性特殊、分布狹窄，常遭遇地毯式地采光挖凈，面臨種源斷絕的危機，已被列為國家Ⅱ級重點保護野生植物［12，13］。目前常用的耐缺氧類西藥如乙酰唑胺等雖然療效較好，但仍有較多副作用［14］。而耐缺氧、抗疲勞中藥及復方作用效果好兼具補益功效且副作用較少［15］，值得深入研究。植物多糖具有較好的抗氧化、耐缺氧作用［16-18］。復方中黃芪、黃精、枸杞子等多糖含量較高，且紅景天苷、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮苷等有效成分極性較大，適合用大極性溶劑提取。而水作為常用溶劑安全性較高，因此在前期醇-水提工藝的基礎上考慮直接水提的方法。為此本實驗設計小鼠常壓耐缺氧實驗、亞硝酸鈉中毒存活實驗和急性腦缺血缺氧實驗，在動物水平評價復方紅景天及復方黃芪先醇提后水提和全方水提方法對藥效的影響，以確定其處方是否可以剔除瀕危藥材紅景天，為紅景天的資源保護提供新的思路。

Tab.4 Effects of different herbal compound and extracts from different extraction methods on T-AOC，SOD，GSH，CAT and MDA in mouse brain tissues（±s，n=30）

Tab.4 Effects of different herbal compound and extracts from different extraction methods on T-AOC，SOD，GSH，CAT and MDA in mouse brain tissues（±s，n=30）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the blank control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs the compound Danshen Group；△P＜0.05 vs Compound Rhodiola alcohol-water extract group；▲P＜0.05 vs Compound Rhodiola water extract group；○P＜0.05，○○P＜0.01 vs Compound Astragalus alcohol-water extract group

Group T-AOC（U/mg prot）SOD（U/mg prot）GSH（mg GSH/g prot）CAT（U/mg prot）MDA（nmol/mg prot）Control 0.74±0.22 1.03±0.20 0.62±0.30 2.50±0.95 4.90±1.48 Compound Danshen 2.61±0.35** 1.20±0.24 1.45±0.18** 2.60±0.51 4.58±0.88 Compound Rhodiola 1.04±0.38 1.42±0.52* 1.53±0.36** 3.10±0.69 4.39±0.58 Compound Rhodiola 1.01±0.34 1.31±0.30 1.61±0.40** 3.20±1.14 4.34±1.42 Compound Astragalus 1.01±0.25 1.15±0.14 0.80±0.31 2.95±0.46 4.66±1.20 Compound Astragalus 1.05±0.23* 1.64±0.50**##△▲○○1.80±0.56**#○ 4.17±1.68**## 3.28±0.88**#○

為了保證藥效結果的可靠性，參考文獻方法［19，20］，本試驗選用復方丹參滴丸作為陽性對照。實驗結果表明，復方黃芪水提物可顯著延長小鼠常壓耐缺氧存活時間，且效果優于陽性對照藥復方丹參滴丸；亞硝酸鈉注射作為一種化學缺氧的方法，也可評價不同藥物的耐缺氧作用。亞硝酸鈉入血后，將正常的二價鐵氧化成三價鐵使紅細胞失去載氧能力，最終使動物因缺氧死亡。本實驗對小鼠腹腔注射亞硝酸鈉后，各給藥組小鼠存活時間沒有明顯延長，且死亡較快，分析原因可能是各藥物組沒有明顯保護亞硝酸鈉中毒的作用，也可能是亞硝酸鈉濃度過高，毒性太強對小鼠造成的傷害無法恢復［20］。陽性對照藥復方丹參滴丸、復方紅景天醇-水提取物、復方黃芪醇-水提取物及水提物對小鼠斷頭后張口喘氣次數較空白對照組均有顯著增加，但與陽性對照藥復方丹參滴丸比較無統計學差異。

缺氧誘發機體發生氧化應激反應，產生大量的自由基攻擊機體細胞或組織，嚴重時引起機體器官損傷，產生病變［21］。大腦易受到缺氧的影響，本實驗測定小鼠腦組織中的T-AOC、SOD、GSH、CAT活性、MDA含量，能夠比較客觀的反映各藥物組在缺氧時對機體的保護作用。T-AOC、SOD、GSH和CAT作為重要的抗氧化物酶，其含量高低反映機體清除自由基和分解過氧化物的能力。MDA是脂質過氧化的產物，其含量高低能夠間接反映細胞的受損程度［22］。與陽性對照藥復方丹參滴丸組相比，復方黃芪水提物組小鼠腦組織除T-AOC活性有所下降外，SOD、GSH和CAT活性都顯著增加，MDA含量顯著下降，表明復方黃芪水提物組對缺氧引起的氧化應激有一定程度的保護作用。綜合實驗結果表明各給藥組對缺氧引起的氧化應激均有不同程度的干預作用，可能是各藥物組具有耐缺氧作用的機制之一。以上結果提示復方黃芪水提物的耐缺氧效果最好，原復方紅景天全方可以剔除紅景天由黃芪、黃精、枸杞子組成，其制備提取方法為水提。