時鐘基因BMAL1在運動性骨骼肌損傷恢復中的作用*

傅澤鋌，夏 雨，丁海麗

（成都體育學院，四川 成都 610041）

生物節律通過時鐘基因的表達調控人體各組織器官的機能，時鐘基因的表達隨著晝夜時間（circadian time，CT）改變而變化，對人體多種生理活動有重要影響。骨骼肌作為外周組織也受時鐘基因調控，大腦/肌肉芳香經受體核轉位因子樣蛋白1（brain and muscle ARNT-like1，BMAL1）作為核心時鐘基因，參與肌生成的過程［1］；細胞骨架有維持細胞內部結構的功能，可將它分為三種類型的蛋白質纖維，即微絲（microfilament）、微管（microtubule）和中間絲（intermediate-filament）。其中，中間絲在細胞質內形成一個完整的支撐網架系統，在細胞內和細胞間都起著多方面的結構作用。骨骼肌細胞骨架按位置可分為肌小節內骨架、肌小節外骨架和肌細胞膜骨架，肌小節外細胞骨架主要由中間絲構成［2］，結蛋白（DESMIN）作為主要的肌肉特異性中間絲，貫穿Z線使肌原纖維連接起來，同時DESMIN也是新肌生成的重要標志［3］。

運動性骨骼肌損傷（exercise-induced muscle damage，EIMD）是骨骼肌在長時間及大負荷運動下，產生的一種骨骼肌纖維損傷。已證實一次性90 min下坡跑步可造成運動性骨骼肌損傷［4］。運動作為一種條件刺激可引起骨骼肌時鐘基因相位的改變。研究表明［5，6］，小鼠在一天中非活動時間運動可以引起BMAL1的mRNA表達發生變化，計劃性運動可影響骨骼肌自身節律表達，使時鐘基因相位前移2～3 h，但不影響中樞節律變化；而人類的急性運動也會引起骨骼肌核心時鐘基因表達改變［7］。盡管這些研究證明骨骼肌核心時鐘基因在運動中表達會發生改變，并且參與新肌生成，但運動誘發的骨骼肌損傷修復過程中的關系尚不明確?；诖?，本研究采用一次下坡跑建立大負荷運動大鼠模型，通過分析時鐘基因BMAL1的周期性節律表達變化趨勢及mRNA表達；觀察大負荷運動后骨骼肌肌纖維超微結構；檢測BMAL1、DESMIN的蛋白表達；觀測二者共定位情況，以此探討時鐘基因BMAL1在運動性骨骼肌損傷恢復中與骨架蛋白DESMIN之間的關系，為肌肉運動能力的恢復以及治療肌肉相關疾病提供新的思路與實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性8周齡SPF級SD大鼠共208只，（283.17±4.06）g，購于成都達碩實驗動物有限公司。于成都體育學院實驗動物房每籠4只分籠飼養，定時訓練，室溫20～26℃，相對濕度40%～70%，自由飲水飲食。實驗室光照與黑暗時間12 h交替，CT0（即光照起始時間）為早8：00開燈；CT12（即光照結束時間）為晚20：00熄燈。實驗中動物處置符合國家科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規定，獲得成都體育學院倫理委員會批準。

1.2 實驗動物分組與干預方案

將208只實驗大鼠隨機分為兩組，對照組（Control，C，n=104）和運動組（Exercise，E，n=104）。依據時間點進一步分為13亞組（n=8）：即刻組（CT0），運動后6 h組（CT6），運動后12 h組（CT12），運動后18 h組（CT18），運動后24 h組（CT24），運動后30 h組（CT30），運動后36 h組（CT36），運動后42 h組（CT42），運動后48 h組（CT48），運動后54 h組（CT54），運動后60 h組（CT60），運動后66 h組（CT66），運動后72 h組（CT72）。

大負荷離心運動方案：參考Armstong離心運動方案［8］，使用小動物電動跑臺對大鼠進行訓練。E組在正式實驗前進行適應性跑臺訓練3 d，第1日坡度0°，速度16 m/min，運動時間5 min；第2日坡度0°，速度16 m/min，運動時間10 min；第3日休息，第4日進行一次持續性下坡跑，坡度-16°，速度16 m/min，運動時間90 min。

1.3 實驗標本取樣

實驗大鼠分別在安靜和運動后即刻0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h、72 h時分批處死并取材。所有大鼠取材前稱量空腹體重，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后開腹分離并剪取腓腸肌，放入冰臺上的錫紙，小心去除肌腱和結締組織。取材過程中，避免肌肉牽拉。把處理后的腓腸肌肌腹分為三段，其中一段大小為1 mm×1 mm×3 mm，然后放入4℃預冷的3%戊二醛固定液，用于透射電鏡觀察；剩余部分平均分成兩段，一段放入4%多聚甲醛溶液中，保存于4℃，用于免疫熒光共定位觀測；另一段用錫紙包裹后放入液氮迅速降溫，然后保存于-80℃，用于Western blot法及實時熒光定量PCR檢測。

1.4 透射電子顯微鏡觀察骨骼肌纖維超微結構變化

將腓腸肌1）戊二醛固定；2）四氧化鋨再固定；3）丙酮脫水；4）樹脂包埋；5）制備切片；6）JEM-1400透射電鏡觀察。采用透射電鏡（型號JEM-1400PLUS，日本電子（JEOL）生產）觀察腓腸肌的肌原纖維特征，包括肌小節排列順序、肌節明/暗帶分布情況、線粒體改變情況。先將骨骼肌切段后樣品預固定（3%戊二醛）后再固定（1%四氧化鋨），經丙酮逐級脫水，按比例設置脫水劑的濃度（在100%濃度中更換3次），處理后的骨骼肌樣品使用脫水劑，后經過環氧樹脂包埋，制備約50 nm切片后，漂浮于刀槽液面上，再撈至銅網，分別通過醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色10～15 min和1～2 min，透射電鏡觀察采圖。

1.5 實時熒光定量PCR檢測核心時鐘基因mRNA表達

將100 mg組織在液氮中磨碎加入1 ml已預冷的Trizol，依次采用氯仿、異丙醇、75℅乙醇經反復離心分離提純樣本總RNA，經超微量紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度和純度后，將RNA逆轉錄合成cDNA。

采用PIKORed 96（美國ThermoFisher生產）實時熒光定量PCR檢測BMAL1的mRNA表達水平，所有引物均交由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成，并以ULTRAPAGE純化。BMAL1的上游引物序列為5′-TGCCACCAATCCATACAC-3′，下游引物 序 列 為5′-TTCCCTCGGTCACATCCTAC-3′；βactin的上游引物序列為5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCC-3′，下游引物序列為5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′。使用Thermo Scientific PikoReal軟件分析PCR過程各檢測樣本的CT（Threshold cycle）值。通過2-△△CT計算X相對mRNA表達水平。

1.6 免疫印跡法檢測骨骼肌細胞BMAL1、DESMIN的蛋白含量

取適量每周期始末肌肉樣本，經過裂解、低溫離心收集上清液，用Bradford法蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，并進行蛋白變性處理。使用PAGE凝膠快速制備試劑盒（7.5%）制膠，上樣：40μg（10 g/L）蛋白；電泳：穩定電壓100 V，15 min；轉膜：200 mA轉膜1～2 h；封閉PVDF膜2 h。孵育Ⅰ抗的濃度分別為：BMAL1和DESMIN，1∶1 000；GAPDH，1∶10 000。Ⅱ抗孵育稀釋濃度為1∶10 000。將PVDF膜平鋪到曝光板上，利用ECL發光液顯影、定影，最后用天能GIS機箱控制軟件2.0對條帶進行曝光掃描，結果以目的蛋白相對表達量表示。

1.7 免疫熒光染色標記骨骼肌細胞BMAL1與DESMIN共定位情況（雙染）

1）固定好的大鼠腓腸肌組織通過全自動脫水機進行脫水、包埋、切片。2）石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15 min，二甲苯Ⅱ15 min，二甲苯Ⅲ15 min，無水乙醇Ⅰ5 min；無水乙醇Ⅱ5 min，85%酒精5 min，75%酒精5 min，蒸餾水洗；3）抗原修復：將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0），微波爐高火加熱10 min，?；? min，中高火再加熱10 min；冷卻后，PBS洗3次，每次5 min；4）血清封閉：滴加山羊血清封閉液，室溫靜置20 min；5）滴加一抗，4℃條件靜置過夜；6）PBS洗3次，每次5 min；7）滴加二抗，37℃30 min；8）PBS洗3次，每次5 min；9）滴加DAPI，室溫孵育10 min；PBS洗3次，每次5 min；10）使用抗熒光衰減封片劑封片。

1.8 統計學處理

應用余弦分析軟件circacompare（R package）獲取擬合余弦曲線參數，其擬合的余弦函數方程為Y=Mesor+Amplitude×cos（time_Radians-φ），其中Mesor為基線/中值；Amplitude為節律震蕩的振幅；φ為峰值相位；time Radians為時間所對應的弧度值。

2 結果

2.1 一次大負荷離心運動對骨骼肌時鐘基因節律震蕩的影響

結果顯示：C組BMAL1基因呈現節律性表達，72 h內共呈現3個完整節律周期。C組擬合余弦函數曲線顯示，BMAL1 mRNA于CT 0.25（早上8：25）處于峰值，隨后下降到CT 12.25（晚上8：25）為谷值，然后回升至CT 24（24 h，1 d）完成一個周期節律振蕩；E組BMAL1基因表達在72 h中節律性喪失，0～24 h節律出現紊亂，24～48 h節律有所恢復，48～72 h與C組相似（圖1，表1）。

Fig.1 Bmal1 mRNA expression and the rhythmic changes of the fitted cosine function

Tab.1 Parameters of BMAL1 mRNA expression in fitting cosine function

2.2 各組對應時相骨骼肌核心時鐘基因表達的比較分析

統計結果顯示：E組BMAL1 mRNA含量呈現先升高，后趨于正常的狀態，在0 h、6 h、12 h和18 h顯著高于C組對應時相（P＜0.05，表2）。

2.3 一次大負荷離心運動對骨骼肌纖維超微結構變化的影響

C組肌纖維超微結構整齊，肌節均勻，z線清晰，肌原纖維排列整齊，線粒體分布均勻，形態正常。E組運動后0 h，肌節變寬，z線模糊不清呈水波狀，肌原纖維斷裂、扭曲，間隙增大；12 h組，肌纖維大面積溶解，整個視野內無法看清整齊的肌原纖維和肌節，z線消失；24 h組，肌原纖維彎曲，排列不規則，間隙依然比較大；48 h組，骨骼肌超微結構扭曲的形態開始恢復；72 h組，骨骼肌超微結構扭曲的形態基本恢復（圖2）。

Tab.2 The relative expressions of BMAL1 mRNA at different phases after a high-load exercise（±s，n=8）

Tab.2 The relative expressions of BMAL1 mRNA at different phases after a high-load exercise（±s，n=8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group at the same phase

Group C E CT0 1.402±0.081 1.967±0.129*CT6 1.213±0.151 1.508±0.043*CT12 1.005±0.057 1.943±0.214*CT18 1.245±0.195 1.923±0.070*CT24 1.572±0.282 1.460±0.285 CT30 1.225±0.073 1.312±0.059 CT36 1.017±0.244 0.963±0.066 CT42 1.322±0.135 1.148±0.131 CT48 1.625±0.155 1.485±0.061 CT54 1.455±0.210 1.238±0.135 CT60 1.062±0.147 1.043±0.172 CT66 1.228±0.064 1.253±0.073 CT72 1.502±0.314 1.578±0.088

Fig.2 Skeletal muscle myofibrils of rats under high power electron microscopy

2.4 一次大負荷離心運動對骨骼肌BMAL1、DESMIN蛋白表達的影響

BMAL1蛋白表達統計結果顯示，與C組相比，E組BMAL1蛋白表達在運動后0 h、12 h顯著上升（P＜0.05），24 h至72 h恢復至與C組無明顯差異（圖3，表3）。DESMIN蛋白表達統計結果顯示：與C組相比，E組DESMIN蛋白表達在運動后0 h、12 h顯著下降（P＜0.05）；24 h開始逐漸升高，48 h表達達到最高，與C組存在顯著性差異，至72 h與C組相比無顯著性差異（P＞0.05，圖3，表4）。

Fig.3 The protein expressions of BMAL1 and DESMIN after a high-load exercise

2.5 一次大負荷離心運動后骨骼肌細胞BMAL11與DESMIN共定位變化

免疫熒光共定位結果顯示：C組五個時相Pear-son系數小于0.5，Overlap系數小于0.6，均不存在共定位現象（圖4，表5）；與C組相比，E組在運動后0h的Pearson系數為0.822022、Overlap系數為0.819980，12h的Pearson系數為0.888031、Overlap系數為0.889843，24 h的Pearson系數為0.831670、Overlap系數為0.832746，說明存在共定位現象；48 h的Pearson系數大于0.5，但Overlap系數小于0.6，72 h的Pearson系數小于0.5，Overlap系數小于0.6，說明不存在共定位現象。0～24 h共定位呈現先降低后升高的趨勢，24 h的熒光強度達到最高值（圖5，表5，6）。

Tab.3 The relative expressions of BMAL1 protein at different phases after ahigh-load exercise（±s，n=8）

Tab.3 The relative expressions of BMAL1 protein at different phases after ahigh-load exercise（±s，n=8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group at the same phase

Group C E CT0 0.851±0.075 1.451±0.081*CT12 0.978±0.080 1.644±0.059**CT24 1.025±0.094 1.288±0.360 CT48 1.052±0.051 0.907±0.111 CT72 1.095±0.010 0.949±0.349

Tab.4 The relative expressions of DESMIN protein at different phases after ahigh-load exercise（±s，n=8）

Tab.4 The relative expressions of DESMIN protein at different phases after ahigh-load exercise（±s，n=8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group at the same phase

Group C E CT0 1.036±0.062 0.687±0.012*CT12 0.784±0.010 0.426±0.054**CT24 0.958±0.088 1.009±0.030 CT48 1.032±0.005 1.339±0.038**CT72 1.255±0.118 1.308±0.074

Fig.4 Co-localization of BMAL1 and DESMIN aggregates at different phases at Group C after a high-load exercise

Fig.5 Co-localization of BMAL1 and DESMIN aggregates at different phases at Group E after a high-load exercise

Tab.5 The Pearson's correlation and overlap coefficient of colocalization of BMAL1 and DESMIN（±s，n=8）

Tab.5 The Pearson's correlation and overlap coefficient of colocalization of BMAL1 and DESMIN（±s，n=8）

Group Phase Pearson's correlation（Rr）Overlap coefficient（R）C E CT0 0.375368 0.402997 0.822022 0.819980 C E CT12 0.216996 0.239659 0.888031 0.889843 C E CT24 0.462627 0.496067 0.831670 0.832746 C E CT48 0.302091 0.319237 0.528399 0.411978 C E CT72 0.425345 0.430837 0.347045 0.383269

Tab.6 Immunofluorescence intensity of light BMAL1 and DESMIN after a high-load exercise（±s，n=8）

Tab.6 Immunofluorescence intensity of light BMAL1 and DESMIN after a high-load exercise（±s，n=8）

Group C E CT0 / 0.854±0.017 CT12 / 0.669±0.004 CT24 / 1.083±0.031 CT48 / /CT72 / /

3 討論

骨骼肌具有內在固有的周期性晝夜節律，該節律由時鐘基因驅動產生。嚙齒動物的日常作息為晝伏夜出，活躍時期一般在夜間，研究發現小鼠夜間晚期運動優于夜間早期［9］；對人體骨骼肌活檢發現，時鐘基因BMAL1在CT12到CT24期間，mRNA表達上升達到峰值［10］，形成約24 h周期循環。運動作為一種授時因子可影響骨骼肌節律變化，同時受到骨骼肌固有時鐘的調控。研究表明，晝夜節律紊亂模型小鼠的運動能力比正常小鼠顯著降低，而運動可通過改變骨骼肌節律來恢復肌肉正常的代謝功能［11，12］。本研究對未施加干預的C組SD大鼠骨骼肌BMAL1 mRNA進行檢測，并獲取擬合余弦曲線參數分析其變化趨勢，發現72 h內上述基因均呈現3個完整近日節律周期，即晝夜節律振蕩。進一步分析其振蕩曲線的峰值與谷值，發現C組BMAL1 mRNA在CT0到CT12期間由波峰降至波谷，在CT12到CT24期間回升至波峰，而E組BMAL1 mRNA在運動后第1日（0 h～24 h）出現近日節律消失，第2日（24 h～48 h）和第3日（48 h～72 h）基本恢復，表明一次大負荷運動可誘發骨骼肌核心時鐘基因節律振蕩紊亂。

下坡跑步作為一種全身性運動，因可使肌肉產生離心運動而廣泛用于研究肌肉損傷的生理變化。一次大負荷運動可誘發運動性骨骼肌損傷［4］，導致骨骼肌纖維超微結構發生改變，骨架蛋白發生降解，肌小節結構破壞，DESMIN纖維絲斷裂；Z線模糊、破壞或消失是在離心收縮后肌纖維觀察到的典型特征［13］。DESMIN在運動后12 h降解最為顯著，大約在運動后48 h表達開始升高，此時重新生成新的肌原纖維［14，15］。在本研究中，骨骼肌在運動性骨骼肌損傷的修復過程中，BMAL1的晝夜節律遭到破壞，其mRNA含量在運動后0 h、6 h、12 h、18 h顯著性上升，蛋白表達在運動后0 h、12 h顯著性升高，24 h即與C組無明顯差異，這與先前的研究結果相符合［16］。DESMIN的蛋白表達在運動后0 h、12 h發生顯著性下降，24 h表達逐漸恢復，升高至48 h與C組存在顯著性差異，先前的證據也顯示骨骼肌細胞在離心運動后的增殖表現出時序性［17］。我們在每個晝夜節律周期始末觀察肌纖維超微結構，同時分析比較E組與C組對應時相基因及蛋白表達情況，結果顯示E組相比于C組在晝夜節律表達均受到破壞的0 h、12 h、24 h存在顯著性差異，同時肌纖維超微結構改變在0 h、12 h、24 h也較為明顯；24 h～48 h時BMAL1節律發生偏移，而48 h時刻點的肌纖維超微結構仍有損傷現象，48 h～72 h隨著BMAL1晝夜節律的恢復，肌纖維超微結構損傷也明顯減輕。提示時鐘基因對維持骨骼肌質量及結構具有重要作用，當晝夜節律紊亂時，骨骼肌會發生細胞水平的結構和功能改變，包括最大肌力的降低、肌絲結構紊亂以及線粒體形態的異常［18］。有報道證明［1］，骨骼肌損傷后，BMAL1的表達發生上調并且促進衛星細胞的生長，而在BMAL1-/-小鼠模型觀察到衛星細胞的再生缺陷，這說明BMAL1是肌肉修復所需的促生肌反應的組成部分。此外，John等學者用轉錄組確定骨架蛋白同樣具有晝夜節律［19］。已有證據顯示BMAL1調控MyoD促進肌生成［18］，并且MyoD可激活DESMIN的表達［20］，這提示大負荷運動后核心時鐘基因BMAL1可能通過調控DESMIN蛋白表達從而影響骨骼肌修復過程。

為進一步探究BMAL1與DESMIN的關系，本研究進行免疫熒光共定位，結果顯示運動后BMAL1和DESMIN在0 h、12 h、24 h出現共定位，在12 h合光強度達到最低，在24 h達到最高值。我們推測，BMAL1受到運動刺激，自身表達發生上升，雖然它能調控骨骼肌修復和再生，但由于骨骼肌損傷的修復和再生階段是一個比較復雜的過程，在骨骼肌發生損傷后，其蛋白質合成受抑制而分解加強，出現蛋白質的凈降解［15］，因此DESMIN在蛋白表達結果上顯示為運動后0 h、12 h表達下降，在共定位結果上顯示為運動后12 h合光強度最弱；在24 h蛋白質合成率逐漸增加后蛋白表達才顯示為上升，在共定位結果上顯示為運動后24 h合光強度最強。

綜上所述，大負荷離心運動可誘導骨骼肌時鐘基因BMAL1節律紊亂，我們初步探討了時鐘基因BMAL1與骨架蛋白DESMIN在大負荷運動后骨骼肌損傷修復過程中存在一定相關性，為恢復肌肉運動能力以及運動員如何緩解高強度訓練后時鐘基因對身體機能的影響提供了實驗依據及參考。但關于BMAL1基因是通過何種途徑來調控DESMIN的，其分子機制仍有待進一步的研究驗證。