臭氧亞慢性暴露對大鼠心臟lncRNA表達譜的影響*

趙 越，田 蕾，閆 峻，李 康，林本成，襲著革，劉曉華

（軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所，天津 300050）

近年來空氣污染問題已成為全球亟待解決的重要環境問題之一，臭氧（ozone，O3）作為環境重要污染物之一，已成為我國夏季大氣首要污染物［1］。中國環境監測總站數據顯示，2019年就有154個城市出現O3高值，且以O3為首要污染物的天數共153 d；2020年，京津冀地區、長江三角地區和汾渭平原O3超標天數占總超標天數的一半［1］。流行病學研究表明O3暴露與人類呼吸系統和心血管系統疾病的發病率和死亡率呈正相關關系［2］。O3暴露可引起黏膜和呼吸道刺激性反應，產生多種細胞因子，這些因子隨血液循環到達其他組織器官，引起全身性反應［3］。

長鏈非編碼RAN（long noncoding RNA，lncRNA）是真核生物DNA轉錄中產生的一類非編碼RNA，其核苷酸數量大于200個堿基，lncRNA功能與其在細胞中的定位相關，在細胞核中的lncRNA主要通過干預染色體來發揮調控功能，在細胞質中的lncRNA通過轉錄調控參與機體生理病理學過程［4］。Janika等人研究表明lncRNA Chat可促進心室重塑［5］，Maria-Teresa Piccoli團隊研究表明Meg3升高可在慢性心肌肥大的基礎上導致心臟纖維化，特異性干擾該基因的表達可顯著改善心臟功能［6］。

目前O3亞慢性暴露對心臟影響的研究較少，深入機制研究更為匱乏。本文首次針對O3亞慢性暴露后大鼠心臟中lncRNA的表達譜變化情況，和差異性lncRNA潛在的生物學功能進行闡述，為預防O3亞慢性暴露對人體的損傷提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物模型構建及樣本采集

從北京維通利華有限公司購入18只6周齡雄性Wistar大鼠，于清潔級動物房中適應性飼養一周后，將其隨機分為清潔空氣組和臭氧暴露組，每組9只。建模期間，將大鼠置于氣體染毒柜（Beijing huironghe，HRH-CSED-K）中，清潔空氣組暴露于過濾空氣中，臭氧暴露組暴露于O3濃度為0.5 ppm（0.980 mg/m3）的混合氣體中，每天6 h，共90 d。暴露結束后大鼠禁食不禁水，次日以3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，經腹主動脈取血后立即摘取心臟，隨后每組取3只大鼠心尖組織置于10%甲醛固定液中用于石蠟切片制備，其余心肌組織于4℃生理鹽水中清洗去除血液后置于液氮中保存。本實驗針對大鼠的所有操作都經過軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所動物倫理委員會的審查和批準。

1.2 總RNA提取及質量控制

根據TRIzol試 劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）說明書從前述實驗中凍存的6只大鼠心臟中提取總RNA，利用RNasey Mini Kit對RNA樣本進行純化，最后采用標準瓊脂糖凝膠電泳對總RNA完整性進行評估，通過Nanodrop ND-1000（Nanodrop，Wilmington，de，USA）對每個樣本中的總RNA進行定量和質量驗證。

1.3 芯片雜交分析

由Arraystar Technologies（Maryland，USA Rockville）設計并生產大鼠lncRNA芯片2.0 V（4×44k），根據Quick Amp Labeling Kit和One-Color試劑盒（Agilent，USA）說明書將1.2中提取的總RNA樣本進行標記并反轉為熒光cRNA，隨后純化并檢測cDNA的質量和濃度。根據Agilent Gene Expression Hybridization試劑盒（Agilent，USA）說明書進行雜交實驗，通過Agilent Scanner G2505C對實驗結果進行掃描，通過R（3.1.2版）對原始數據進行處理。

1.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）實驗

從芯片結果中選取6個差異性顯著的lncRNA（3個顯著上調，3個顯著下調）進行驗證，以GAPDH為內參，利用Primer 5.0設計引物。用TRIzol試劑提取前述實驗中凍存的心肌組織中總RNA，去除基因組DNA，根據RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒（Thermo，US）進行反轉錄實驗（30℃10 min；42℃50 min）。qRT-PCR實驗主要儀器為Bio-Rad iq5（Bio-Rad，US）；主要試劑為Fast-Start Essential DNA Green Maste（Roche）qRT-PCR，條件為85℃10 min，每組六次平行實驗。

1.5 GO和KEGG分析

基因本體論（Gene Ontology，GO）（http：//www.geneontology.org）分析包括生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三個部分，使用Fisher檢驗進行統計學檢驗，P（P＜0.05）值越小，GO項越顯著；京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）（https：//www.genome.jp/kegg/）用于描述差異性lncRNA可能參與的信號通路，P（P＜0.05）值越小，KEGG項越顯著。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 O3亞慢性暴露對大鼠心臟中lncRNA表達譜的影響

我們采用芯片雜交技術對O3亞慢性暴露后大鼠心臟中lncRNA表達變化情況進行分析。箱式圖描述了臭氧暴露組與清潔空氣組數據分布情況，結果顯示六組數據分散情況基本一致（圖1A）。熱圖結果表明，與對照組相比，臭氧暴露組中大量lncRNA表達量發生改變（紅色為表達上調，綠色為表達下調，圖1B）?；鹕綀D結果顯示差異性lncRNA中顯著上調的有167個（紅色），顯著下調的有64個（綠色，圖1C）。

Fig.1 Overview of differentially expressed lncRNA

2.2 O3亞慢性暴露大鼠心臟中差異表達lncRNA分類

通過對差異表達lncRNA進行分類分析，結果顯示差異性上調的lncRNA中含量最多的是基因間lncRNA（灰色，34%）、外顯子有義重疊型lncRNA（橙色，32%）和內含子有義重疊型lncRNA（黃色，21%）；差異性下調的lncRNA中含量最多的是基因間lncRNA（灰色，46%）、雙向型lncRNA（深藍色，22%）和外顯子有義重疊型lncRNA（橙色，20%）。在全部lncRNA中占比最多的是基因間lncRNA（灰色），最少的是天然反義型lncRNA（綠色，圖2）。

Fig.2 Classification of the differentially expressed lncRNA

2.3 差異表達lncRNA表達量驗證

根據芯片雜交分析結果，我們利用qRT-PCR方法對表達變化最顯著的6個lncRNA（LOC102554403、LOC103693964、LOC108349594、LOC102554241、LOC102547903、LOC102552250）的表達趨勢進行驗證。qRT-PCR結果顯示，LOC102554403、LOC103693964和LOC108349594表達 上 調，LOC102554241、LOC102547903和LOC102552250表達下調，且變化倍數＞2，這一結果與芯片分析結果一致，即芯片結果可信（圖3）。

Fig.3 LncRNA expression level validated by microarray and qRT-PCR（±s，n=6）

2.4 O3亞慢性暴露大鼠心臟中差異表達lncRNA的GO分析

GO分析結果表明，顯著上調的lncRNA主要參于生長發育過程和細胞對外界刺激性的反應；在細胞中主要存在于細胞質中；可能具有黏著功能（GO：0005488）和與其他物質相結合的功能（表1）。

顯著下調的lncRNA主要參與細胞器定位（GO：0051640）和物質分解代謝的過程；在細胞中主要定位于纖毛纖維過渡、濃縮的染色體外著絲粒和微管中；可能通過調節氧化還原酶活性發揮調控功能（表2）。

2.5 O3亞慢性暴露大鼠心臟中差異表達lncRNA的KEGG分析

KEGG分析結果表明顯著上調的lncRNA主要參與PI3K-Akt信號通路、脂肪酸降解、甲狀腺激素等信號通路；顯著下調的lncRNA主要參與各種維生素和主要供能物質的代謝過程，并可能調控藥物代謝細胞色素P450等過程（表3）。

3 討論

O3是目前大氣污染中重點防治對象之一，O3對哺乳動物和人的影響主要集中于呼吸系統，研究表明O3急性暴露導致肺部發生廣泛性、持續性的炎癥，使機體免疫功能降低、肺上皮細胞增生和肺纖維化［3］。在本研究中我們采用芯片技術研究證實O3亞慢性暴露可導致大鼠心臟中lncRNA表達譜發生變化，顯著上調的lncRNA有167個，顯著下調的lncRNA有64個（FC≥1.5和P＜0.05），其中數量最多的是基因間lncRNA。

Tab.1 GO analysis for up-regulated lncRNA after ozone subchronic exposure

Tab.2 GO analysis for down-regulated lncRNA after ozone sub-chronic exposure

GO分析結果表明差異性上調的lncRNA可能主要參與生長發育過程，大量研究表明發育過程較為復雜的生物體內的lncRNA可能通過RNA修飾參與調節生長發揮過程，與心臟發育密切相關的基因有Bvht、Fendrr等，其中lncRNA SRA1和Linc-MD可通過海綿作用調控細胞分化［7］，本研究也發現大量與發育相關的lncRNA，GO分析提示這些差異表達的lncRNA可能參與調控細胞發育、器官生長發生或系統發育過程；此外還可能參與細胞對化學刺激和有機物刺激的應激過程，有研究表明O3急性暴露可使神經體液因子失調，這些神經體液因子隨循環系統到達全身各處，造成機體代謝紊亂，Miller DB等人的研究表明O3大多在呼吸道發生反應并產生大量應激因子和脂質代謝物，如IL-6、內皮素、纖維蛋白原等，同時檢測結果表明循環系統中上述物質表達量顯著升高［8］，而這些物質在循環中的升高可導致內皮功能障礙，造成血栓和動脈粥樣硬化［2］。

Tab.3 KEGG analysis for differentially expressed lncRNA after ozone sub-chronic exposure

KEGG分析結果表明差異性上調的lncRNA可能主要參與PI3K-Akt信號通路，有大量研究揭示PI3K-Akt信號通路在多種心臟疾病和功能損傷等病理進程中發揮重要調節作用，該通路的激活可調節細胞生長與增殖，氧化應激激活該通路使心肌細胞凋亡加快［9］，敗血癥誘導的心臟功能障礙中PI3K和Akt去磷酸化導致細胞炎癥與凋亡，在心肌肥大的研究中發現PI3K/Akt/mRNA信號通路活化后，可通過Bcl-2誘導細胞自噬［9，10］。其次，差異性上調的lncRNA也可能參與調節脂肪酸代謝，脂肪酸氧化分解可產生ATP，在成年心臟中脂肪酸是主要能量代謝物質［11］，脂肪酸代謝超過一定的限度可抑制心臟糖酵解過程，從而導致能量供給不足，使心臟功能降低，在臨床治療中通常通過直接增加糖酵解或抑制脂肪酸代謝來改善心臟功能［12］，實驗證明棕櫚酸酯可誘導心肌細胞肥大和心肌細胞死亡相關基因、蛋白質表達升高［13］，結合我們實驗室前期實驗結果，我們可以假設O3暴露可能通過線粒體氧化應激途徑對心臟造成損傷；近年來有體外實驗證明lncRNA參與調控脂肪酸代謝過程，LINC00473在脂肪細胞中特異性表達，該基因的表達量與線粒體氧化代謝能力相關，在調節脂肪酸解代謝也有重要作用，核lncRNA Blinc1參與調控生熱脂肪細胞的發育，lncBATE10通過抑制Ppargc1a mRNA基因的表達使細胞產熱［14］。

差異表達下調的lncRNA可能主要參與氨基酸代謝過程，心臟可以分泌大量谷氨酸和丙氨酸，有研究表明支鏈氨基酸分解代謝受損使心臟更容易發生缺血/再灌注損傷，這主要是通過抑制小鼠體內葡萄糖代謝和O-GlcNAc的蛋白修飾來實現的［15］；γ-氨基丁酸主要參與調節心血管生理病理進程，在慢性心力衰竭患者血中總氨基酸和多種分類氨基酸含量均降低，其中天冬氨酸、蛋氨酸和牛黃酸含量與心臟功能衰減程度有正相關關系［16］。谷氨酰胺是癌癥細胞中重要的能量代謝物質，lncRNA可調節癌癥中谷氨酰胺代謝，如肝內膽管癌中lncRNA TUG1表達升高與該疾病愈后差密切相關，抑制lncRNA TUG1表達后谷氨酰胺消耗和能量產生顯著減少，lncRNA EPB41L4A-AS1表達量降低可使HeLa和HepG2細胞對谷氨酰胺的依賴性增強，同時加快谷氨酰胺的代謝，在膀胱癌細胞中抑制lincRNA-p21的表達也可以使谷氨酰胺代謝加速，而過表達lincRNA-p21可抑制癌細胞增殖［17］。

KEGG分析結果表明差異性下調的lncRNA主要參與維生素的調節，流行病學研究和大量實驗研究證明維生素D在心肌細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞中有重要作用［18］，25-OH D水平降低可激活腎素-血管緊張素系統和左心室心肌肥厚，體內維生素D不足與心血管疾病發病機制密切相關，Zhou等人研究發現缺乏維生素D可增加人群心血管疾病發病風險，維生素D水平過低的患者發生心臟病的風險更高，而且該人群血壓更高［19］。維生素E是一種重要的脂溶性抗氧化劑，流行病學研究、體外實驗和動物實驗研究結果表明維生素E升高可抑制低密度脂蛋白氧化所誘導的動脈粥樣硬化斑塊的進一步發展［20］，這為維生素E治療與脂質氧化相關心血管疾病提供重要數據支撐。

我們實驗中發現的大量lncRNA可能參與調節心臟中能量和營養物質代謝，目前對營養物質在心血管疾病中的研究僅是冰山一角，需要深入研究，并且營養素補充對疾病的治療在用量和方法上都難以從動物試驗中推廣到人群實驗中。lncRNA在心臟中的研究在功能和調控機制尚未闡述完全，由于ln-cRNA保守性差，因此動物實驗研究結果向臨床試驗外推十分困難，lncRNA在臨床治療方面尚處空白階段，因此對心臟中lncRNA功能和調控機制研究十分必要，而我們的研究對治療心臟疾病的可能有重大推進作用。