羅布麻的抗衰老作用機制研究

王 飛，李祥婷，徐莉莉，張雅珍，向 軍,3*

1.復旦大學附屬中山醫院藥劑科，上海 200032

2.復旦大學附屬中山醫院中西醫結合科，上海 200032

3.復旦大學中西醫結合研究院內科研究所，上海 200032

羅布麻屬夾竹桃科植物［1］，是藥食同源植物，具有廣泛的藥用和保健功效。臨床研究發現羅布麻葉浸膏片可改善夜尿等部分衰老癥狀，對降低血清過氧化脂質、升高發鋅、提高男性血漿睪丸酮可能具有一定作用［2］；可提高老年人自然殺傷細胞活性及紅細胞超氧化物歧化酶含量，改善甲皺微循環的血流狀態，有一定延緩衰老的作用［3］。在動物模型中，羅布麻提取物可延長果蠅壽命，促進家兔及大鼠的免疫功能，降低大鼠血清過氧化脂質水平［4］。鑒于羅布麻抗衰老的多成分、多靶點的藥理學特征，本研究擬借助網絡藥理學結合動物模型進一步探討羅布麻的抗衰老作用和機制。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學研究

1.1.1 羅布麻成分收集和篩選 采用數據庫TCMSP（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）、TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid/）與文獻檢索相結合的方法收集羅布麻的主要活性成分。根據藥物動力學參數對其進行篩選，該參數為藥物口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%以及類藥性（drug likeness, DL）≥0.18。

1.1.2 羅布麻成分靶點預測 采用中藥成分靶點數據庫TCMSP、TCMID 結合文獻檢索的方法收集和篩選羅布麻的成分靶點。

1.3 衰老的疾病靶點預測 在疾病靶點數據庫OMIM（https://omim.org/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、GeneCards（http://www.genecards.org/），以關鍵詞“aging”獲得衰老的相關基因。

1.4 靶點的蛋白互作網絡 利用Venny 2.1 獲得羅布麻成分與疾病靶點的交集，隨后導入STRING（http://stringdb.org/），進行蛋白互作分析，結果 以 TSV 格 式 導 入 Cytoscape 3.8.1（http://www.cytoscape.org/）軟件進行網絡拓撲結構分析，構建蛋白-蛋白相互作用網絡。

1.5 成分-靶點-疾病網絡構建 利用Cytoscape 3.8.1（http://www.cytoscape.org/）將上述所得結果網絡拓撲結構分析，構建成分-靶點-疾病網絡。

1.6 靶點功能和通路富集分析 利用基因本體（gene ontology, GO） 數 據 庫 和 京 都 基 因 與 基因 組 百 科 全 書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG） 數 據 庫， 以 及R3.6.3 軟 件 運行的Bioconductor 生物信息軟件包（http://www.bioconductor.org/）對靶點功能和通路進行富集分析。

1.2 動物實驗

1.2.1 實驗動物 C57-BL/6 小鼠，雄性，8 周齡，體質量18～20 g，由復旦大學附屬中山醫院動物實驗中心提供。動物使用通過復旦大學附屬中山醫院動物倫理委員會審核［動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005；動物使用許可證號：SYXK（滬）2016-0006］。

1.2.2 藥物和試劑 羅布麻提取物（日本常盤生藥研究所）、D-半乳糖（美國Sigma 公司）、蘇木精-伊紅(H-E)染液（江蘇凱基生物技術股份有限公司）、兔抗鼠p53 一抗 (江蘇Immunoway公司）、兔抗鼠GAPDH （江蘇凱基生物技術股份有限公司）、FITC 標記羊抗兔二抗（Jackson ImmunoResearch 公司）、羊抗兔IgG-HRP（江蘇凱基生物技術股份有限公司）。

1.2.3 實驗儀器 電泳儀（美國Bio-Rad 公司）、Trans-Blot Turbo 全能型蛋白轉印系統（美國Bio-Rad 公司）、凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）、電熱扶風干燥箱（上海圣欣科學儀器有限公司）、BX43 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2.4 動物分組與給藥 將小鼠隨機分為對照組、模型組、羅布麻組，每組6 只。參考既往研究［5］，模型組和羅布麻組頸背部皮下注射5% D-半乳糖（100 mg·kg－1·d－1），對照組同部位注射等體積生理鹽水。參考既往研究［6］羅布麻給藥劑量，羅布麻組在注射D-半乳糖的同時，給予 100 mg·kg－1·d－1的羅布麻提取物灌胃，模型組每天等體積生理鹽水灌胃，連續造模和給藥8 周。

1.2.5 組織取材 造模8 周后頸椎脫臼處死小鼠，暴露胸腹部，常規消毒，打開腹腔，取小鼠肝臟組織，液氮速凍后轉入－80 ℃保存，用于后續H-E 染色、免疫熒光染色和Western 印跡檢測。

1.2.6 H-E 染色 取肝臟組織，4%多聚甲醛固定，脫水、包埋，制備4 μm 石蠟切片，隨機選取肝臟切片（n=3），經梯度二甲苯脫蠟、梯隊乙醇復水，行H-E 染色，脫水、透明、封片。光鏡下觀察肝臟組織大體病理改變。

1.2.7 免疫熒光染色 取肝臟組織，制備4 μm 冰凍切片，隨機選取肝臟切片（n=3），1%丙酮固定，經3% H2O2-甲醇溶液滅活、1% BSA 封閉后，p53一抗（1 ∶ 100）37℃孵育 2 h，FITC 標記熒光二抗（1 ∶ 200）37℃孵育 2 h，DAPI 復染，熒光顯微鏡下觀察p53 的表達情況。

1.2.8 Western 印跡法 取肝臟組織，提取總蛋白，樣品經過蛋白質含量測定后，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜，BSA 封閉，采用1 ∶ 1 000 稀釋的一抗 4℃孵育過夜，1 ∶ 1 000 稀釋的二抗37℃孵育1 h，增強化學發光法反應，曝光，顯影，拍照，光密度定量分析。

1.3 統計學處理 實驗所得數據均采用SPSS 13.0統計軟件包進行分析，結果以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準（α）為0.05。

2 結 果

2.1 網絡藥理學預測

2.1.1 羅布麻活性成分篩選及其靶點 經數據庫查找出56 個活性成分，篩選并去重后獲得谷甾醇（sitosterol）、花青素B1（procyanidin B1）、山奈酚（kaempferol）、(+)-兒茶素［(+)-catechin］、木犀草素（luteolin）、表兒茶素（ent-Epicatechin）6 個活性成分，及羅布麻寧（apocynin）、金絲桃苷（hyperoside）、蕓香苷（rutin）3 個活性成分，共計9 個活性成分（表1）。利用數據庫查詢上述活性成分的靶點信息，篩選并去重后得到122 個作用靶點。

表1 羅布麻主要活性成分信息

2.1.2 羅布麻抗衰老的潛在靶點 通過GeneCards數據庫、DisGeNET 數據庫、TTD 數據庫、OMIM數據庫篩選出共計2 183 個與衰老相關靶點，采用Venny 2.1 軟件與羅布麻活性成分靶點交集，得到85 個共同靶點（圖1）。

圖1 羅布麻活性成分靶點與衰老靶點交集Venny 圖

2.1.3 成分-靶點-疾病網絡 運用Cytoscape 3.8.1軟件構建成分-靶點-疾病網絡（圖2），共132個節點和276 條邊。山奈酚、木犀草素以及蕓香苷與靶點的聯系最為廣泛。

圖2 羅布麻成分-靶點-疾病網絡

2.1.4 潛在靶點的蛋白-蛋白互作網絡 根據蛋白互作網絡（圖3A），篩選出degree 值排名前30位的靶點，其中p53、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白細胞介素-6（IL-6）等可能是抗衰老的主要潛在靶點（圖3B）。

圖3 潛在靶點的蛋白-蛋白互作網絡

2.1.5 GO 分子功能富集分析 結果（圖4）顯示：通過GO 富集分析，篩選出85 個靶點116 個分子功能條目（P＜0.05），主要為磷酸酶結合、泛素樣-蛋白連接酶結合、蛋白磷酸酶結合、氧化還原酶活性、細胞因子受體結合、血紅素結合、四吡咯結合、泛素蛋白連接酶結合以及細胞因子活性等。

2.1.6 KEGG 通路富集分析 結果（圖5）顯示：通過KEGG 通路富集分析篩選出85 個靶點163 條信號通路，主要與磷脂酰肌醇3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（phosphoinositide3-kinase-Akt, PI3KAkt）信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE（advanced glycation end product-receptor for advanced glycation end product）信號通路、內分泌抵抗、IL-17 信號通路、T 細胞受體信號通路等。

圖5 KEGG 通路富集分析氣泡圖

2.2 羅布麻對小鼠的影響

2.2.1 羅布麻對衰老小鼠一般情況的影響 與對照組小鼠比較，模型組小鼠出現精神萎靡，倦怠嗜睡，喜扎堆，進食減少，毛色枯槁無光澤、易脫落，皮膚彈性差等衰老體征，羅布麻組小鼠上述情況改善。

2.2.2 羅布麻對衰老小鼠肝臟組織的影響 對照組小鼠肝小葉、匯管區等結構基本完整，肝細胞形態基本正常，無變性和壞死；模型組小鼠肝組織發生肝細胞排列紊亂，肝細胞脂肪變性、局灶壞死、驗證細胞浸潤等退行性改變；羅布麻組小鼠肝組織肝細胞排列稍紊亂，肝細胞脂肪變性、局灶壞死、驗證細胞浸潤等退行性改變較模型組小鼠減輕（圖6）。

圖6 小鼠肝臟組織H-E 染色

2.2.3 羅布麻對衰老小鼠p53 表達的影響 采用Western 印跡法檢測羅布麻對關鍵靶點p53 表達的影響（圖7A、7B）：與對照組比較，模型組小鼠p53的表達水平顯著上調（P＜0.01）；羅布麻組小鼠p53 的表達水平上調，但低于模型組（P＜0.05）。采用免疫熒光檢測小鼠p53 的表達（圖7C）：羅布麻組p53 表達較模型組減弱。

圖7 小鼠肝臟p53 表達分析

3 討 論

3.1 羅布麻抗衰老機制的網絡藥理學預測 本研究通過文獻和網絡數據庫篩選出金絲桃苷、木犀草素、蕓香苷、兒茶素、羅布麻寧等關鍵活性成分。在衰老大鼠模型中，金絲桃苷通過抑制自噬衰老進程中的腎臟結構老化、損傷，緩解其功能衰退［7］。蕓香苷可上調衰老相關基因叉頭框蛋 白O（forkhead box protein O，FoxO） 及 抗 氧化基因錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD） 和 過 氧 化 氫 酶（catalase,CAT）的表達，進而提高高脂飲食飼養的果蠅對冷熱休克、饑餓應激的抵抗能力，并延長其壽命［8-10］；木犀草素可上調sirtuin 1 和p53 的表達，進而減輕H2O2誘導的氧化應激性細胞衰老［11］；兒茶素可提高機體的抗氧化能力，促進大腦單胺能神經遞質的分泌，改善衰老進程中的腦功能和日常生活活動能力［12］；羅布麻寧是天然的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原酶（NADH）氧化酶抑制劑，可通過調控一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的表達，調控衰老進程中血管結構老化和功能衰退［13-15］。

通過數據庫檢索篩選出85 個作用靶點，其中核心靶點為p53、AKT1、IL-6、INS。p53 是重要的轉錄因子，在細胞應激反應、細胞增殖與凋亡、DNA 修復、衰老細胞微環境調控過程中發揮重要作用［16］。在線蟲和小鼠衰老模型中發現，p53 通過負向調控細胞自噬延緩衰老［17］。AKT 在細胞存活和凋亡中起重要作用，活化的AKT 通過磷酸化多種激酶和轉錄因子等調節細胞功能，包括p21、p27、Foxo 等衰老相關分子［18］。胰島素抵抗是衰老在代謝上的重要特點之一［19］，并進一步介導衰老進程中的炎癥環境改變［20］。衰老狀態下循環炎癥標志物處于高水平，其中超過800 個基因轉錄與IL-6 有關［21-22］。

通過KEGG 通路富集分析篩選出PI3K-AKT、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE、內分泌抵抗、IL-17、TNF-α 等信號轉導通路，其在衰老過程中調控細胞存活和凋亡、代謝、炎癥反應等關鍵生物學過程。

3.2 羅布麻的抗衰老作用和靶點的實驗驗證 在以往羅布麻抗衰老研究［2-4,6］基礎上，本研究采用D-半乳糖皮下注射構建衰老小鼠模型，觀察到羅布麻可改善衰老小鼠的一般衰老癥狀和體征，減輕衰老導致的肝臟組織病理學改變，抑制衰老進程中肝臟組織p53 表達的上調。p53 作為一種轉錄因子發揮作用，通過結合啟動子區域來上調或下調特定靶基因的表達，通過結合內含子位點促進選擇性轉錄，從而調控下游靶基因和效應器。p53 及其調控的信號網絡能促進受損細胞的修復、存活或消除，在衰老過程中發揮重要作用。在不同的環境下，p53 可選擇性臨時阻止細胞分裂，啟動DNA 修復機制，無法使DNA 修復時誘導細胞死亡，或者進入DNA復制性衰老狀態［23］。動物模型中，衰老與p53 活化有關，p53 缺失則可抑制衰老表型的發生［24-25］。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學方法預測了羅布麻抗衰老的多個成分和多個靶點，并通過動物模型驗證了羅布麻可能通過下調p53 的表達發揮其抗衰老作用，但其調控p53 的上游途徑，以及下游靶基因和效應器尚有待進一步探討。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。