ZK93426 促進小鼠精子獲能相關蛋白酪氨酸磷酸化的機制研究*

馬 婕 王曉琛 劉 強

上海交通大學醫學院 組織胚胎學與遺傳發育學系(上海 200025);上海市生殖醫學重點實驗室(上海 2000025)

哺乳動物新鮮射出的精子必須在女性生殖道完成獲能和頂體反應才具備受精的能力,精子獲能的主要標志為1)細胞膜膽固醇流失,細胞膜通透性加強[1];2)胞內pH 升高[2];3)蛋白酪氨酸磷酸化水平升高[3];4)胞內鈣離子濃度增加[4];5)精子發生超激活運動[5];6)細胞質膜超極化[6]等。 盡管關于獲能相關的分子機制研究已經取得很大進展,但具體機制還亟待深入研究。

GABAA受體是中樞神經系統受抑制性神經遞質γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)調節的離子型受體,哺乳動物中有19 種編碼GABAA受體亞基的基因,包括α1-6,β1-3,γ1-3,ρ1-3,δ,ε,θ 和π[7]。 GABAA功能性受體通常包含5 個亞基,5 個亞基圍繞使中央形成一個Cl-和HCO-3選擇性的離子通道[8]。 眾多的亞基導致體內可能存在數百個GABAA受體亞型,神經系統中最豐富的亞型是α1β2γ2[9]。 GABAA受體上有一位點可結合苯二氮卓類藥物,該位點被稱為苯二氮卓類受體(benzodiazepine receptor,BZR)。 GABAA受體中的αx+/γy-(x=1,2,3,5,y=1-3)亞基交界面是苯二氮卓類藥物的高親和位點[10]。 在生殖系統中,已有研究發現GABA 可以在體外促進哺乳動物獲能相關蛋白酪氨酸磷酸化和頂體反應的發生[11-14]。 在男性精漿[15],女性輸卵管、卵巢等組織[16]中均發現了GABA 的存在,在人[17],小鼠[12],大鼠[18]等精子中,也發現存在GABAA亞基。 但GABAA受體在精子中的表達模式和發揮功能的具體機制還有待研究。

ZK93426 是一類β-咔啉衍生物,是高效的,選擇性和競爭性的苯二氮卓類受體拮抗劑[19],具有微弱的反向激動效應。 之前的研究中,我們發現苯二氮卓受體拮抗劑ZK93426 可促進小鼠和人精子獲能相關蛋白酪氨酸磷酸化升高,并且依賴于獲能培養液中的和BSA 的存在,使用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制劑H89 可抑制ZK93426 的促進作用,表明ZK93426作用于PKA 上游發揮其促進功能[20]。 本文中我們研究了ZK93426 對精子生理指標的影響,以期揭示其促進蛋白酪氨酸磷酸化的機制。

材料與方法

一、試劑與儀器

(一)主要試劑

ZK93426 購于Tocris;二甲基亞砜(DMSO)、精子培養緩沖液(modified Krebs-Ringer medium,HM)、精子獲能緩沖液(modified Krebs-Ringer bicarbonate medium,HMB)相關配制試劑購自Sigma-Aldrich;Fluo4-AM,Pluronic F-127 (0.04% w/v),DiSC3(5)(3,3'-二丙基噻二碳青碘化物)購自Invitrogen;BCECF-AM[2,7'-雙-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基熒光素,乙酰甲氧基甲酯],MQAE[N-(乙氧基羰基甲基)-6-甲氧基溴化喹啉]購自碧云天生物技術有限公司;Valinomycin,CCCP(羰基氰化物3-氯苯腙)購于MedChem Express;考馬斯亮藍G-250購自國藥集團化學制劑有限公司。

(二)主要儀器

恒溫培養箱(Heal Force);計算機輔助精液分析系統(Computer-Aided Sperm Analysis, CASA)(Hamilton Thorne);Gemini XPS 熒光讀板儀(Molecular Devices);CytoFlex S 流式細胞檢測儀(BeckMan)。

二、實驗方法

(一)小鼠精子的獲得

小鼠精子培養緩沖液HM 及獲能緩沖液HMB 按照Pietrobon 等人所描述的方法配制[21]。

根據上海交通大學醫學院IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)的指導準則對實驗小鼠C57BL/6 進行安樂死。 取小鼠附睪尾部于37℃預熱的HM 培養液中,并將其剪碎,37℃,5% CO2的條件下,使附睪尾部精子上游。 15min 后,棄組織碎片,并用HM清洗精子2 次。 使用HM 重懸精子,并調整濃度為2×107/mL。

(二)精子胞內鈣離子濃度[Ca2+]i測定

[Ca2+]i的變化通過裝載離子探針Fluo4-AM,并通過流式細胞儀進行測定。 精子懸液在Pluronic F-127(0.04% w/v)的存在下,與終濃度為2μM 的Fluo4-AM探針于37℃孵育20min,多余的染料通過離心洗去,重懸于HM 培養液中,并于37℃孵育30min 以去酯化,Fluo-4 AM 進入細胞后可以被細胞內的酯酶剪切形成Fluo4,從而被滯留在細胞內。 500×g 離心5min,去上清,將精子重懸于HMB 中,調整濃度為0.5-1×107/mL,加入50μM ZK93426 或DMSO 或10μM A23187 于37℃,5% CO2條件下孵育30min,于第28min 時,加入2ng/μL PI 染色2min。 隨后立即使用流式細胞儀檢測[Ca2+]i變化。 A23187 為鈣離子載體,可促進鈣離子大量內流,因此作為陽性對照。

(三)精子胞內氯離子濃度[Cl-]i測定

精子懸液與5 mM MQAE 于37℃孵育45min,離心洗去多余染料,將精子重懸于HMB 中,調整濃度為0.5 ～1×107/mL。 熒光讀板機測定355/460nm 處的熒光值,待熒光值穩定后加入DMSO 或50μM ZK93426 通過ΔF/F0 顯示[Cl-]i水平的變化。 ΔF 為加入藥物前后的熒光值差,F0 為加入藥物前的平均基礎熒光值。

(四)精子pHi測定

精子與終濃度為3μM 的BCECF-AM 于37℃共孵育30min,離心洗去多余染料,重懸于HM 緩沖液中并于37℃去酯化30min,500×g 離心5min 后將精子重懸于HMB 中,隨后上機測定。 用490nm 和440nm 波長激發BCECF 所得到的發射熒光之比與pH 有很好的線性關系。 待熒光值穩定后加入DMSO 或ZK93426。 最終通過ΔR/R0 顯示胞內pH 的變化,ΔR 為加入藥物前后的熒光比值差,R0 為加入藥物前的平均基礎熒光比值。

(五)精子細胞膜電位Em 測定

通過熒光染料DiSC3(5)測定精子細胞膜電位的改變。 當細胞膜超極化時,染料進入細胞,與細胞內蛋白質結合后淬滅其熒光,并在其光譜中表現出輕微的偏移,其熒光信號降低。 將精子細胞重懸于HMB 培養液中,加入50μM ZK93426 并于體外獲能30,60,90min,并分 別 在 第 22, 52, 82min 時( 提 前 8min) 加 入DiSC3(5)(1μM)孵育5min 后,加入終濃度為1μM 的CCCP 孵育3min,使用熒光讀板機監測620/670nm 下熒光值變化,通常1 ～2min 熒光值達到穩定。 通過添加1μM Valinomycin 和不同濃度的KCl 來校正Em。 假設[K+]i為120mM,根據能斯特方程,初始KCl 濃度為4.77mM,對應Em 值為-86mV,額外加入KCl 使其終濃度為8、12、20 和36mM,分別對應于-72,-61,-47 和-32mV的質膜電位。 非獲能組精子細胞重懸于HM 中,其余操作相同。

(六)統計分析

使用GraphPad Prism 8 進行統計學分析及繪圖。曲線圖使用雙因素方差分析(two-way ANOVA)進行統計學分析,多組之間的比較使用Bonferroni 校正。 柱狀圖使用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行統計分析。 對僅有兩組的數據使用T檢驗進行統計分析。 所有數據以Mean±S. E. M 表示。 當p＜0.05 時認為具有統計學差異,*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001。 所有實驗至少重復3 次。

結 果

一、ZK93426 促進小鼠獲能過程中精子[Ca2+]i升高

通過熒光探針Fluo4-AM 檢測小鼠精子[Ca2+]i變化。結果表明,與DMSO 對照相比,小鼠精子與ZK93426于獲能培養液中共孵育30min 后,精子[Ca2+]i顯著升高(圖1)。

圖1 ZK93426 處理導致小鼠獲能過程中精子[Ca2+]i升高

A-C:PI 熒光與Fluo4 熒光流式散點圖及直方圖:根據PI熒光值區分死(第一、二象限)、活(第三、四象限)細胞群體,在活細胞群體中根據Fluo-4 熒光強度區分低(直方圖左側)或高(直方圖右側)Fluo-4 熒光值細胞所占比例。 分別表示DMSO(A)、ZK93426(B)、A23187(C)處理30min 精子[Ca2+]i改變。 D. ZK93426 處理組與DMSO 溶劑對照組和陽性對照組A23187 的高Fluo-4 熒光群體百分比對比統計圖。n=3,***p＜0.001。

二、ZK93426 處理導致小鼠精子獲能過程中[Cl-]i降低

通過氯離子探針MQAE 檢測了小鼠精子[Cl-]i的改變。 MQAE 的檢測靈敏度高,是一種目前應用最廣泛的新型氯離子探針,當[Cl-]i升高時,MQAE 的熒光強度隨著氯離子濃度的增加而成比例地減少。 我們使用熒光讀板機實時檢測小鼠精子獲能過程中[Cl-]i的改變,可見加入ZK93426 后,精子[Cl-]i顯著降低(圖2)。

圖2 ZK93426 處理導致小鼠精子[Cl-]i降低

A.MQAE 測定精子胞內氯離子濃度改變,可見ZK93426處理后,精子細胞胞內熒光升高,表示[Cl-]i降低。 B.ZK93426處理組與溶劑對照組(DMSO)的MQAE 熒光值統計比較。圖2A 中箭頭指示加入藥物的時間點。n=6,***p＜0.001。

三、ZK93426 處理加速小鼠精子獲能過程中胞內堿化

通過pH 探針BCECF-AM 實時監測小鼠精子pHi的變化。結果顯示,加入ZK93426 可在5min 內快速促進pHi升高(圖3)。

圖3 ZK93426 處理導致小鼠精子獲能過程中pHi升高

使用BCECF-AM 測定小鼠精子pHi變化,可見ZK93426促進小鼠精子獲能過程中胞內堿化。n=4,***p＜0.001。

四、ZK93426 抑制小鼠精子獲能過程中細胞膜超極化

通過熒光探針DiSC3(5)檢測了小鼠精子細胞膜電位改變。 在小鼠精子懸液中加入ZK93426 或DMSO 于37℃獲能30,60,90min 后,檢測精子細胞膜電位。結果顯示,小鼠精子獲能過程中細胞膜逐漸超極化(圖4A、B 和D),但ZK93426 可抑制獲能過程中細胞膜的超極化(圖4C 和D)。

圖4 ZK93426 抑制小鼠精子獲能細胞膜超極化

A.非獲能培養液中,小鼠精子細胞膜電位。 B-C:獲能培養液中,小鼠精子與ZK93426(C)或DMSO(B)孵育30,60,90min 后,小鼠精子的膜電位值。 D. 細胞膜電位統計圖,n≥3,*p＜0.05,***p＜0.001。

討 論

精子睪丸后成熟依賴于男性和女性生殖道的微環境,附睪尾部是一個低Na+,Cl-,HCO-3的弱酸性環境,這種環境對于維持精子靜止狀態至關重要,當精子進入女性生殖道后,精子暴露于高Cl-,HCO-3,Ca2+的環境中,這些離子流入精子細胞膜后會激活cAMP/PKA 級聯化反應,并且誘導了胞內堿化,蛋白酪氨酸磷酸化的發生及細胞膜的超極化,并最終使精子完成獲能并獲得受精能力[2]。

本文延續之前的研究,對ZK93426 促進的蛋白酪氨酸磷酸化的機制進行了進一步的探究。 HCO-3和Ca2+是調控精子獲能相關蛋白酪氨酸磷酸化的兩個重要離子,Ca2+可以增加ATP 對sAC:可溶性腺苷酸環化酶(Soluble adenylate cyclase,sAC)的親和性,并促進sAC 對HCO-3的敏感性[22]。 HCO-3可以激活sAC 以產生大量cAMP 來激活PKA,從而激活下游一系列級聯反應最終導致蛋白酪氨酸磷酸化水平升高[23]。 其中HCO-3在獲能期間的內流又會導致胞內pH 的升高,胞內的堿化又會激活pH 依賴性鈣離子通道CatSper 及鉀離子通道Slo3 的開放,進而分別調控胞內鈣離子濃度及細胞膜電位的變化[23]。 我們的結果表明ZK93426 快速促進小鼠精子pHi升高,并導致[Ca2+]i水平顯著升高。 考慮到之前的研究中我們發現ZK93426 促進的蛋白酪氨酸磷酸化升高是依賴于HCO-3且ZK93426 作用于PKA 上游發揮功能,我們推測ZK93426 極有可能是通過促進HCO-3內流從而快速激活cAMP/PKA 通路來促進蛋白酪氨酸磷酸化的升高。 此外,ZK93426 促進的胞內堿化也可能激活了CatSper 通道,從而造成[Ca2+]i升高。

我們的結果還表明ZK93426 處理后[Cl-]i降低。Cl-在調控蛋白酪氨酸磷酸化中也發揮了重要功能。 當培養基中不添加Cl-時,獲能相關蛋白酪氨酸磷酸化無法發生,加入cAMP 類似物可以恢復獲能相關蛋白酪氨酸磷酸化,表明Cl-作用在cAMP/PKA 上游發揮功能[24]。 此外,有研究發現,孕酮處理人精子也會導致瞬時胞內Cl-的外流,并且加入GABAA受體抑制劑后,Cl-外流受到抑制[25]。 Cl-也是激活大鼠GABAA受體必不可少的離子[26]。 這提示我們Cl-外流在ZK93426 促進的蛋白酪氨酸磷酸化中可能也發揮了重要功能。

由于ZK93426 處理導致了[Cl-]i降低,細胞膜電位也受到了影響。 我們推測ZK93426 促進Cl-外排導致的細胞去極化也可能激活了某些電壓鈣離子通道(voltage-gated Ca2+channel,Cav)從而導致[Ca2+]i增加。已知弱去極化可打開Cav3通道,而強去極化可打開Cav1和Cav2通道[27]。 盡管早期研究中無法檢測到附睪尾成熟精子的Cav 電流,但是后續的研究認為是由于精子的成熟狀態和技術限制造成的無法檢測,并且證明了Cav2.3參與調控精子頂體反應和鈣離子內流[28]。

綜上所述,本文的結果表明ZK93426 可能通過調控[Ca2+]i,[Cl-]i,pHi及Em 來共同調節小鼠精子獲能相關蛋白酪氨酸磷酸化的升高。 該結果可為精子獲能的機制提供一定的理論基礎。