姜黃素對青春前期大鼠睪丸缺血/再灌注Nrf2 蛋白表達的影響*

張建華 孟繁亮 朱 薇 章學文 王 俊 陳思思

湖州市第三人民醫院(浙江 湖州 313000)

睪丸扭轉是一種常見的泌尿外科急癥,該病早期誤診率較高,可達67.6%[1]。 一旦確診需急診手術復位,恢復睪丸血供,挽救睪丸功能。 研究發現:睪丸扭轉復位是一種典型的缺血/再灌注損傷(Ischemiareperfusion injury, IRI)[2],目前對IRI 的研究主要集中在心、腦血管等方面,對于睪丸損傷后萎縮、生殖細胞凋亡的研究較少。 活化的核因子E2 相關因子-2(NFE2-related factor 2,Nrf2)是內源性抗氧化系統的關鍵分子,其與細胞核內抗氧化反應元件(Antioxidant response element,ARE)結合,構成Nrf2/ARE 信號通路,是機體重要的內源性抗氧化應激通路[3]。 目前關于Nrf2 蛋白在心臟和腦組織中的病理生理機制研究報道較多,但關于Nrf2 蛋白在大鼠睪丸缺血/再灌注損傷中的表達、分布規律及作用機制的研究,國內外文獻報道較少。本研究通過建立青春前期大鼠睪丸扭轉復位動物模型,觀察姜黃素(Curcumin,Cur)對青春前期大鼠睪丸扭轉復位后Nrf2 蛋白的表達狀況的影響,探討姜黃素對睪丸缺血/再灌注損傷的保護作用機制,為臨床治療睪丸扭轉復位后生精功能低下提供理論依據。

一、材料與方法

(一)實驗動物、藥品及試劑

SPF 級,4 周齡,雄性SD 大鼠,體重(95±5)g,由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,合格證編號:20170005056712;姜黃素產品,由西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司提供,批號:C1386-5G;Nrf2 多克隆一抗,批號:PB9290,購自武漢博士德生物技術研究所,HRP 免疫組化試劑盒、DAB 試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒,均購自南京建成生物醫學工程研究所。

(二)動物模型建立與分組

本實驗采用4 周齡雄性健康SD 大鼠32 只,隨機分為假手術組、生理鹽水組、姜黃素單次給藥組和姜黃素連續給藥組,每組均為8 只。 所有動物按組分籠飼養。 睪丸扭轉模型采用Turner[4]法建立。 舒泰50(50mg/kg)ip麻醉。

假手術組:將左側陰囊切開,游離左側睪丸后縫合陰囊,關閉切口。

生理鹽水組:將左側陰囊切開,游離左側睪丸后,繞精索順時針扭轉睪丸720°后,用1 號絲線固定睪丸,縫合陰囊,關閉切口。 2h 后,第2 次切開左側陰囊,將扭轉的睪丸復位固定,可見睪丸組織由暗紅色逐漸恢復紅潤。 于復位前30min,灌胃法灌注生理鹽水(劑量生理鹽水200mg/kg)。

姜黃素單次給藥組:方法同生理鹽水組,于復位前30min,灌胃法灌注姜黃素懸液(采用0.5%羥甲基纖維素鈉溶解成懸濁液,劑量Cur 200mg/kg)。

姜黃素連續給藥組:方法同生理鹽水組,于復位前30min,灌胃法灌注姜黃素懸液(劑量Cur 200mg/kg),術后每天同等藥物灌胃1 次,連續7d。

(三)睪丸勻漿的制備和SOD 活性、MDA 含量的測定

于術后6 周處死所有實驗動物,取左側睪丸,剔凈睪丸附著筋膜并用冷生理鹽水洗凈血污,濾紙拭干、稱重。 用電子天平稱取睪丸組織約0.15g,加入9 倍冷生理鹽水并用眼科剪剪碎置于組織勻漿器中,睪丸勻漿以離心力684.21×g 離心15min,取上清液測定各項酶指標。 MDA 和SOD 均采用化學比色法測量。 操作過程嚴格按照試劑說明書進行。

(四)Nrf2 蛋白表達檢測

免疫組織化學染色切片厚4μm,每個標本取4 片,采用免疫組織化學HRP 法染色。 主要步驟:切片常規脫蠟至水→3%H2O2滅活內源性酶→高溫高壓修復抗原→正常山羊血清封閉(不洗)→滴加Nrf2 抗體(1 ∶3200)→生物素化山羊血清→HRP 試劑(在以上各步之間均用PBS 洗滌3min×3 次)→DAB 顯色→蘇木素輕度復染,然后脫水、透明,中性樹膠封片,光鏡觀察。陰性對照應用正常IgG 作為對照,用已知陽性片作陽性對照。 以胞質、胞核呈棕褐色為Nrf2 蛋白陽性表達,計算Nrf2 蛋白核轉位率。

(五)統計學分析

采用SPSS 22.0 軟件,多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間兩兩比較采用SNK法,實驗數據以±s表示,P＜0.05 時認為差異有統計學意義。

二、結果

(一)睪丸組織SOD 活性和MDA 含量的變化(見表1)

表1 各組大鼠睪丸組織SOD 活性和MDA 含量的比較(±s,n=8)

表1 各組大鼠睪丸組織SOD 活性和MDA 含量的比較(±s,n=8)

注:*vs 生理鹽水組P＜0.05;#vs 姜黃素單次給藥組P＜0.05;▲vs 姜黃素連續給藥組P＜0.05。

組別 SOD(U/mg*prot)MDA(nmol/mg*prot)假手術組 167.44±4.82*#▲ 11.08±1.01*#生理鹽水組 72.70±4.43 35.08±2.59單次給藥組 120.99±7.30* 16.87±1.73*連續給藥組 154.58±4.62*# 12.76±1.34*#

與假手術組相比,生理鹽水組SOD 活性明顯降低,MDA 含量顯著增加(P＜0.05);與生理鹽水組相比,姜黃素單次和連續給藥組SOD 活性顯著增加,MDA 含量明顯降低(P＜0.05);與姜黃素單次給藥組相比,姜黃素連續給藥組SOD 活性顯著增加,MDA 含量明顯降低(P＜0.05);與姜黃素連續給藥組相比,假手術組SOD活性顯著增加(P＜0.05)。

(二)Nrf2 蛋白核轉位率變化(見表2)

表2 各組大鼠睪丸Nrf2 蛋白核轉位率的比較(±s,n=8)

表2 各組大鼠睪丸Nrf2 蛋白核轉位率的比較(±s,n=8)

注:*vs 生理鹽水組P＜0.05;#vs 姜黃素單次給藥組P＜0.05;▲vs 姜黃素連續給藥組P＜0.05。

組別 Nrf2 蛋白核轉位率(%)假手術組 33.85±2.41*#▲生理鹽水組 42.30±5.04單次給藥組 43.71±2.65連續給藥組 51.97±4.43*#

與假手術組相比,生理鹽水組Nrf2 蛋白核轉位率顯著升高(P＜0.05);與生理鹽水組相比,姜黃素連續給藥組 Nrf2 蛋白核轉位率顯著升高(P＜0.05);與姜黃素單次給藥組相比,姜黃素連續給藥組Nrf2 蛋白核轉位率顯著升高(P＜0. 05);與姜黃素連續給藥組相比,假手術組Nrf2 蛋白核轉位率明顯降低(P＜0.05)。

(三)Nrf2 蛋白核轉位率和SOD 活性變化(見圖1)

圖1 Nrf2 蛋白核轉位率和SOD 活性變化

(四)睪丸生精小管Nrf2 蛋白表達(見圖2)

Nrf2 蛋白主要表達于睪丸精原細胞、精母細胞的細胞核和細胞質。 圖2 所示,Nrf2 蛋白核轉位率在假手術組最低,缺血再灌注損傷后增強,姜黃素連續給藥處理后,Nrf2 蛋白核轉位率顯著升高,且姜黃素連續給藥組Nrf2 蛋白核轉位率明顯優于單次給藥組。

圖2 不同組別睪丸組織生精小管Nrf2 蛋白的表達(免疫組化HRP,×200)

三、討論

睪丸扭轉復位是一個典型的缺血/再灌注損傷的過程,雖然扭轉的睪丸得到復位后可使血供恢復,但是睪丸在缺血的初期已經發生損害,且在再灌注階段這種損傷反應會加重。 氧自由基損傷,細胞內鈣超載和炎癥遞質是缺血/再灌注損傷的病理生理基礎[5]。 睪丸組織在缺血/再灌注的過程中產生大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS),ROS 可通過直接損害或者經過一系列過氧化鏈式反應而造成廣泛細胞結構的破壞,因此清除ROS 對減輕睪丸的氧化損傷至關重要。SOD 是組織中清除體內超氧離子自由基經典的抗氧化酶之一[6]。 MDA 是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的穩定代謝產物,其含量可以間接反映組織細胞損傷的程度[7]。 本實驗結果顯示,睪丸缺血/再灌注后,睪丸組織SOD 活性明顯降低,MDA 含量顯著增加,提示睪丸扭轉復位可引起大量氧自由基的生成,導致抗氧化能力下降。 姜黃素單次和連續給藥組可以顯著增加SOD 的活性,明顯降低MDA 的含量,提示姜黃素可以降低睪丸缺血/再灌注后氧自由基的生成。

核轉錄因子NF-E2 相關因子2(Nrf2)-抗氧化反應元件(ARE)是目前為止發現的、最為重要的內源性抗氧化信號通路,是機體重要的自我防御系統,激活Nrf2-ARE 信號通路可增加細胞抗氧化蛋白表達,通過抗凋亡、抑制線粒體膜通透性轉換(Mitochondrial permeability transition,MPT)、減輕炎癥等機制減輕IRI[8-9]。 正常情況下,Nrf2 與Keap1(Kelch-like ECHassociated protein-1)以相互結合的方式存在于胞質中,其本身活性也受到相應的抑制,處于無活性狀態[10]。氧化應激產生的ROS 直接或間接地損傷細胞內蛋白質、脂質、核酸等大分子物質的生理功能,是眾多疾病發生的病理生理基礎。 機體形成了一套復雜的氧化應激應答系統,當受到氧化應激信號刺激時,會使Nrf2 與Keap1 解除偶聯,Nrf2 進入細胞核內,與ARE 結合,從而激活Nrf2/ARE 信號轉導通路,啟動受ARE 調控的下游一系列抗氧化因子基因如SOD、HO-1、NQO1 等的轉錄及表達,抗氧化基因的表達上調使細胞的抗氧化應激能力增強[11-12]。 姜黃素(Cur)是一類從傳統中藥姜黃根莖中分離出的天然產物,為多酚類化合物,其脂溶性好,性質穩定[13]。 實驗表明,姜黃素可減輕腦、心臟、肺和腎的缺血再灌注損傷[14-15],其通過抑制黃嘌呤氧化酶、過氧化陰離子、過氧化歧化酶、乳酸脫氫酶等的生成,抑制再灌注損傷導致的細胞凋亡,在缺血再灌注過程中提供保護作用。 本實驗結果顯示,睪丸缺血/再灌注后,睪丸組織Nrf2 蛋白核轉位率顯著升高,提示睪丸扭轉復位后,氧化應激損傷使Nrf2 釋放進入細胞核,激活Nrf2/ARE 信號轉導通路,增強抗氧化損傷能力。 姜黃素連續給藥組比睪丸缺血/再灌注組Nrf2 蛋白核轉位率顯著升高,連續給藥組比單次給藥組Nrf2蛋白核轉位率顯著升高。

從圖1 表明,睪丸扭轉后復位前應用姜黃素及術后連續應用姜黃素,Nrf2 蛋白核轉位率和SOD 活性顯著增加。 推測其機制可能是Nrf2 蛋白核轉位在缺血/再灌注時升高,而此期間睪丸組織損傷程度仍加重,提示此期間睪丸組織內對于應激和氧化損傷雖然有保護性反應,通過增加Nrf2 蛋白核轉位表達以對抗損傷,但是此作用不足以對抗此期間睪丸缺血/再灌注所釋放的活性氧簇、炎性因子等的致損傷作用。 這與程風春[16]報道的結果一致。 應用姜黃素后通過激活Nrf2/ARE信號通路,誘導抗氧化酶SOD 表達,提高睪丸組織清除氧自由基的能力,從而減輕了睪丸組織的氧化損傷。

綜上所述,姜黃素通過激活Nrf2/ARE 蛋白的信號通路,提高SOD 活性,清除氧自由基,降低組織內MDA含量,從而對大鼠睪丸缺血/再灌注損傷有保護作用,且連續應用明顯優于單次應用。 提示我們在臨床工作中對睪丸扭轉復位后患者可考慮及時多次連續應用此類藥物,以防止出現嚴重的IRI,從而影響睪丸組織的生理功能和后期發育。