響應面試驗優化堿提酸沉法提取微胚乳玉米蛋白工藝及其組成分析

衛 萍，張雅媛，游向榮，鄧靜友，周 葵，楊兆杏

(廣西壯族自治區農業科學院 農產品加工研究所，廣西果蔬貯藏與加工新技術重點實驗室，廣西香蕉保鮮與加工工程技術研究中心，南寧 530007)

玉米，同小麥和稻谷并稱為世界三大糧食作物[1]，在糧食作物中位居第3位[2]。我國是全球第二大玉米生產國，僅次于美國，玉米產量占世界總產量的20%[3]。普通玉米中含有70%的淀粉，主要用于生產玉米淀粉[4]，近年來發展了新型高油高蛋白玉米，改善了玉米籽粒的營養成分，研究新型高油高蛋白玉米具有顯著的社會效益和經濟效益。賴氨酸和色氨酸是必需氨基酸，只能從食物中攝取，高蛋白玉米中賴氨酸含量在0.4%以上，其色氨酸含量也比普通玉米高1倍左右。從食用價值方面來看，高蛋白玉米具有改善人體營養的作用，特別是對兒童的身體、智力發育大有裨益，對嚴重營養不良的兒童有一定的治療作用，此外對預防癩皮病也有較好的療效[5]。微胚乳玉米是一種新型高油高蛋白玉米，與普通玉米相比，胚乳含量極低，籽粒含油率高，油酸、VE、甾醇等有益營養成分多，具有玉米的特有香味，榨油后的粕蛋白質含量亦很高，且氨基酸組成合理，深加工潛力大。因而對新型微胚乳高蛋白玉米開展蛋白提取及性質研究，對其后續加工利用具有重要意義。

目前常用的蛋白提取方法有堿提酸沉法[6]、溶劑法[7]、酶法、反膠束萃取法[8]以及微波和超聲波輔助提取法[9-10]等。其中堿提酸沉法因操作簡單、易于控制、成本低廉等優點成為應用最多且已用于工業化的蛋白提取方法[6]。本研究首先采用單因素試驗考察堿提酸沉法提取微胚乳玉米蛋白的主要工藝參數，然后以玉米蛋白得率為指標，采用響應面法優化獲得微胚乳玉米蛋白的最優提取條件，然后對最優條件下提取的微胚乳玉米蛋白和普通玉米蛋白的組成進行了比較，以期為微胚乳高蛋白玉米的綜合開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

微胚乳玉米(水分7.13%、粗脂肪24.7%、粗蛋白質21.6%、總淀粉27.1%、灰分3.2%)，廣西益寶油料玉米有限公司；普通玉米(爆米花用)，廣西南寧市廣百佳超市；氫氧化鈉、鹽酸、冰乙酸、溴酚藍、甘氨酸、甘油、過硫酸銨，均為分析純；丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍R250、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、N，N，N,N-四甲基乙二胺(TEMED，超純級)、β-巰基乙醇(生化級)、標準蛋白，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

JY6002電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；RRH-100萬能高速粉碎機，歐凱萊芙(香港)實業有限公司；L550低速大量離心機，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；PHS-3C pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；LGJ-18冷凍干燥機，北京松源華興科技發展有限公司；XH-C渦旋混合器，江蘇省金壇市榮華實驗器材有限公司；HH-S4數顯恒溫水浴鍋，金壇市萬華實驗儀器廠；DYCZ-25E電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米蛋白等電點的確定

將微胚乳玉米干燥，然后準確稱取50.0 g干微胚乳玉米，粉碎過0.18 mm(80目)篩，經索氏抽提脫脂后按1∶10的料液比加500 mL蒸餾水充分混勻，用1.0 mol/L NaOH調節pH至11，在50℃恒溫水浴中振蕩60 min后以4 000 r/min離心20 min，底部沉淀重復提取1次，將2次提取的上清液合并分別用1.0 mol/L HCl調pH至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，靜置30 min出現分層，以4 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀經真空冷凍干燥后稱質量，計算玉米蛋白得率。以pH為橫坐標，玉米蛋白得率為縱坐標，繪制曲線，曲線中玉米蛋白得率最高的點對應的pH即為玉米蛋白的等電點。玉米蛋白得率按式(1)計算。

Y=m1/m0×100%

(1)

式中：Y為玉米蛋白得率；m1為玉米蛋白(沉淀)質量，g；m0干玉米粒質量，g。

1.2.2 堿提酸沉法提取玉米蛋白

準確稱取一定量的干玉米粒，粉碎過0.18 mm(80目)篩，經索氏抽提脫脂后按一定料液比加蒸餾水充分混勻，用1.0 mol/L NaOH調節至一定的pH，置于一定溫度的恒溫水浴鍋中振蕩提取一定時間后，離心取上清液用1.0 mol/L HCl調pH至玉米蛋白等電點，靜置，待玉米蛋白沉降后以10 000 r/min離心10 min，取沉淀真空冷凍干燥后即得玉米蛋白。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

參照衛萍等[11]的方法進行SDS-PAGE分析，其中樣品制備方法略有修改。樣品制備方法：分別稱取1 mg玉米蛋白溶于5 mL 2倍蛋白樣品緩沖液中，渦旋混合器混勻溶解成透明的深藍色溶液，沸水浴中煮沸10 min使蛋白質充分變性。

1.2.4 氨基酸組成分析

參考GB 5009.124—2016測定樣品的氨基酸組成。

1.2.5 數據處理

每個試驗重復3次。單因素試驗數據利用SPSS17.0軟件進行方差分析，并用Origin 8.1軟件進行繪圖，響應面試驗采用Design Expert 8.0.6.1軟件進行多元回歸擬合及工藝參數優化。

2 結果與分析

2.1 玉米蛋白的等電點

按1.2.1方法測定玉米蛋白等電點，pH與玉米蛋白得率的關系見圖1。

圖1 pH對玉米蛋白得率的影響

由圖1可知，隨著pH的升高，玉米蛋白得率先升高后下降。在pH為5.0時，玉米蛋白得率達到最大值，為19.54%。這是因為在等電點時蛋白質分子顆粒在溶液中不存在同電荷的相互排斥作用，其顆粒極易相互碰撞凝聚而沉淀析出，此時溶液中蛋白質的溶解度最小[10]。因此，確定玉米蛋白的等電點為5.0。另外，試驗中發現二次提取對玉米蛋白得率影響較小，故后續試驗使用一次提取工藝，以便節約時間和成本。

2.2 微胚乳玉米蛋白提取單因素試驗

2.2.1 料液比對玉米蛋白得率的影響

在提取溫度50℃、提取時間60 min、提取pH 11條件下，考察料液比對玉米蛋白得率的影響，結果見圖2。

圖2 料液比對玉米蛋白得率的影響

由圖2可知，隨著料液比的增加，玉米蛋白得率先迅速增加后緩慢增加。在料液比為1∶5時，玉米蛋白得率最低，為9.51%，在料液比為1∶10時玉米蛋白得率迅速增加至18.93%。這是因為在料液比較低時，一方面提取體系黏度大，分子擴散速率低，蛋白質分子的溶出速率低，另一方面蛋白質濃度較高，分子間的相互排斥力阻礙更多蛋白質的溶出[12]，而隨料液比的增加，稀釋作用加強，提取體系的黏度和蛋白質濃度都有所下降，蛋白質溶出增加，從而使玉米蛋白得率增加。但當料液比超過1∶10時，玉米蛋白得率增加放緩，并且與料液比1∶10時的玉米蛋白得率差異不顯著(p>0.05)。分析原因可能是蛋白質的溶解度達到飽和狀態，繼續增加溶劑蛋白質溶解也不明顯[13]。綜合考慮，料液比為1∶10 左右較適宜。

2.2.2 提取pH對玉米蛋白得率的影響

在提取溫度50℃、提取時間60 min、料液比1∶10的條件下，考察提取pH對玉米蛋白得率的影響，結果見圖3。由圖3可知，隨著提取pH的升高，玉米蛋白得率逐漸增大，在提取pH為11.5時達到最大，為18.56%。原因在于堿液能使細胞緊密結構變得疏松，破壞蛋白質分子的次級鍵特別是氫鍵，使玉米蛋白質分子表面帶有相同電荷，促進結合物與蛋白質的分離，使蛋白得率增加[14-15]。當提取pH大于11.5時，玉米蛋白得率反而降低，原因可能是蛋白質水解導致的[10]。另外，試驗中發現，隨著提取pH的升高，玉米蛋白的顏色會變深。因此，選擇提取pH為11.5左右較適宜。

圖3 提取pH對玉米蛋白得率的影響

2.2.3 提取溫度對玉米蛋白得率的影響

在提取時間60 min、提取pH 11、料液比1∶10的條件下，考察提取溫度對玉米蛋白得率的影響，結果見圖4。

圖4 提取溫度對玉米蛋白得率的影響

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，玉米蛋白得率先增大后減小，在提取溫度為50℃時，玉米蛋白得率最大，為18.35%，這與任秀艷等[16]研究獲得的最佳提取溫度一致。當提取溫度高于50℃后，玉米蛋白得率開始顯著下降。分析原因可能是溫度較高時，水發生了解離，Sereewatthanawut等[17]利用色譜分析也證明了水的解離現象，同時在高溫條件下蛋白質會發生降解，共同造成了玉米蛋白得率的降低。因此，選擇提取溫度50℃左右較適宜。

2.2.4 提取時間對玉米蛋白得率的影響

在提取溫度50℃、提取pH 11、料液比1∶10的條件下，考察提取時間對玉米蛋白得率的影響，結果見圖5。

圖5 提取時間對玉米蛋白得率的影響

由圖5可知，隨著提取時間的延長，玉米蛋白得率增加，在提取時間為90 min時，玉米蛋白得率達到最大，為18.10%，之后玉米蛋白得率隨著提取時間的延長反而降低。分析原因可能是提取時間太長，玉米蛋白發生部分變性或降解。因此，適宜的提取時間為90 min左右。

2.3 微胚乳玉米蛋白提取響應面試驗

2.3.1 響應面試驗設計及結果

根據單因素試驗，以料液比(A)、提取pH(B)、提取溫度(C)及提取時間(D)4個因素為自變量，以玉米蛋白得率(Y)為響應值，采用中心組合設計進行響應面試驗，響應面試驗因素與水平見表1，響應面試驗方案及結果見表2。

表1 響應面試驗因素及水平

表2 響應面試驗方案及結果

續表2

2.3.2 回歸模型的建立及方差分析

對表2試驗數據進行擬合，得到二次多項回歸方程：Y=18.44+1.10A+0.30B+2.500E-003C-0.69D-0.23AB+0.038AC+0.22AD-0.68BC-0.071BD+0.29CD-6.042E-003A2-0.62B2+0.038C2-0.39D2。對回歸模型進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析

由表3可知，模型的p小于0.000 1，表明模型差異極顯著，失擬項p為0.359 9，大于0.05，表明失擬項不顯著，說明未知因素對結果干擾很小，該模型基本能反映料液比、提取pH、提取溫度及提取時間與玉米蛋白得率的關系，可以用此模型分析和預測堿提酸沉法提取玉米蛋白的結果。由F值可以看出各因素影響主次順序為A(料液比)>D(提取時間)>B(提取pH)>C(提取溫度)。由p值可知AB、AD交互作用差異高度顯著(p<0.01)，BC、CD交互作用差異極顯著(p<0.001)。

通過對回歸模型求偏導，得到玉米蛋白提取的最優工藝條件為料液比1∶14.75、提取pH 11.4、提取溫度48.95℃、提取時間61.20 min，在此條件下玉米蛋白得率的預測值為20.42%。

2.3.3 驗證試驗

為了檢驗模型預測的準確性，采用響應面優化的工藝條件進行玉米蛋白提取試驗，考慮實際操作的便利，將最優工藝條件修正為料液比1∶15、提取pH 11.5、提取溫度50℃、提取時間60 min。試驗重復3次，實際玉米蛋白得率平均值為20.40%，與理論得率20.42%的相對誤差為0.10%，無顯著性差異，說明模型可以很好地預測微胚乳玉米蛋白提取情況。

2.4 玉米蛋白的分子質量分布

分別以微胚乳玉米和普通玉米為原料，按照1.2.2方法，在響應面優化的微胚乳玉米蛋白提取最優工藝條件下，提取微胚乳玉米蛋白和普通玉米蛋白，并對兩種蛋白進行SDS-PAGE分析，結果見圖6。

注：條帶1、2、3、4分別代表Marker(標準蛋白)、普通玉米蛋白、微胚乳玉米蛋白、Marker圖6 玉米蛋白SDS-PAGE分析圖

以標準蛋白的遷移率和分子質量對數制作工作曲線，再根據被測蛋白的遷移率估算其分子質量。由圖6可見，微胚乳玉米蛋白與普通玉米蛋白出現條帶的位置基本一致，且分子質量分布均小于60 kDa，普通玉米蛋白有5條主帶，分子質量分別為55.59、40.62、30.46、24.82、19.21 kDa，微胚乳玉米蛋白亦有5條主帶，分子質量分別為55.59、40.62、30.46、24.82、18.14 kDa，但是二者在15～20 kDa之間出現的條帶略有不同，說明微胚乳玉米蛋白與普通玉米蛋白組成有區別，這可能會導致二者加工性質方面有所差異，有待進一步研究驗證。

2.5 玉米蛋白的氨基酸組成

對最優工藝條件下提取的微胚乳玉米蛋白和普通玉米蛋白的氨基酸組成進行分析，結果如表4所示。

表4 玉米蛋白氨基酸組成及含量 %

由表4可見，玉米蛋白中共檢出16種氨基酸，種類較為齊全，未檢測到色氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺和胱氨酸，可能是因為在酸性條件下水解，色氨酸被沸酸完全破壞，天門冬酰胺和谷氨酰胺側鏈的酰胺基也被水解成了羧基。普通玉米蛋白和微胚乳玉米蛋白包含7種人體必需氨基酸(色氨酸除外)，分別占氨基酸總量的35.44%和36.15%，兩種玉米蛋白的蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、組氨酸含量較少，但是谷氨酸、亮氨酸、精氨酸、天門冬氨酸含量較高，其中普通玉米蛋白這4種氨基酸分別占氨基酸總量的16.92%、9.50%、7.56%和7.50%，微胚乳玉米蛋白這4種氨基酸分別占氨基酸總量的17.56%、11.77%、7.09%和7.49%。高含量的谷氨酸是表征玉米蛋白的一個重要特性，這與唐紅明[18]報道的結果相似。谷氨酸可促進機體生物代謝，提高大腦思維活躍水平，可用于治療神經衰弱和記憶力減退[19]。

3 結 論

在單因素試驗的基礎上，利用響應面法建立了微胚乳玉米蛋白提取工藝的二次項數學模型，該模型擬合度良好。影響微胚乳玉米蛋白得率的因素主次順序為料液比>提取時間>提取pH>提取溫度，最優提取工藝條件為料液比1∶15、提取pH 11.5、提取溫度50℃、提取時間60 min。在最優條件下，微胚乳玉米蛋白得率為20.40%。對最優條件下提取的微胚乳玉米蛋白與普通玉米蛋白進行SDS-PAGE分析，二者出現的條帶位置基本一致，只是在15～20 kDa出現的條帶略有不同。兩種玉米蛋白的氨基酸種類一致，較為齊全，同時谷氨酸、亮氨酸、精氨酸、天門冬氨酸含量較高，其中微胚乳玉米蛋白的必需氨基酸含量較普通玉米蛋白高。本試驗結果為進一步研究利用新型微胚乳玉米蛋白提供了良好的研究基礎。