電針“內關”、“足三里”對腦梗死大鼠梗死體積及尼氏小體的影響*

王斌華，吳新貴，劉學謙，潘 劍

（廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧 530021）

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）是我國最常見的一種腦血管疾病，且其發病率、致殘率、致死率較高，據中國國家腦卒中篩查數據顯示，我國40～74 歲人群首次急性腦梗死標化發病率由2002年的189/10萬上升到2013年的379/10萬，平均年增長8.3%[1]，嚴重危害人們的勞動能力和生活質量[2]。腦梗死可歸納于中醫“卒中”或“中風”范疇。中國很早就有使用針灸療法來治療卒中的記載，最早可見于《黃帝內經》，如《靈樞·熱病》：“偏枯，身偏不用而痛……巨針取之，益其不足，損其有余，乃可復也”。其后的《針灸甲乙經》及《針灸大成》也有針灸治療卒中的描述，《針灸甲乙經》：“偏枯，四肢不用，善驚，大巨主之”；《針灸大成卷五·八脈圖》：“中風偏枯，疼痛無時：絕骨、太淵、曲池、肩髃、三里、昆侖”等。電針療法是現代技術與傳統醫學相結合的產物，操作時將針刺入穴位獲得針感后，在毫針針柄上接通電針儀上的電線，利用針刺和脈沖電刺激相結合以防治疾病的方法。此療法的優點就是能代替人工操作，節省人力，又能控制刺激量。接通電流后逐漸調整電流大小，調節到患者能耐受的程度。電針有止痛、鎮靜、促進氣血循環、調整肌張力等作用，電針療法已被廣泛的應用于臨床中。大量的臨床研究和基礎研究[3-4]都證實電針療法是針對腦梗死安全、有效、可行的治療方法。本課題組前期研究發現[5-6]，電針能夠改善腦梗死大鼠肢體運動功能、促進腦梗死大鼠腦梗死區及梗死對側大腦生長相關蛋白GAP-43（growth associated protein-43）的表達，減輕腦梗死雙側神經細胞的損傷。

尼氏小體是僅存在于神經元細胞胞體中及樹突內的一種顆粒，它的數量及形態與神經元受損傷程度成正比，因此常被用來作為評價神經元功能正常與否的指標。課題組前期研究還發現，電針可以促進局灶性腦梗死大鼠梗死對側的尼氏小體增加，進而使局灶性腦梗死大鼠運動功能得到恢復[7]。大腦中動脈梗塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠梗死側大腦皮層的梗死體積及尼氏小體數量的增減變化與腦梗死后運動功能的恢復有何聯系，以及電針干預對這種聯系的影響如何，未見相關研究。本實驗選取“內關”、“足三里”兩穴進行電針干預，觀察MCAO大鼠梗死側大腦皮層的神經細胞尼氏小體的增減變化、腦梗死體積及其與腦梗死后運動功能的恢復之間的關系，為臨床運用電針治療腦梗死提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

使用健康的成年雄性SPF級SD（Sprague-Dawley，SD）大鼠54只，體重240～300 g，大鼠年齡在7～8周之間（合格證號：SCXK桂2020-0003），由廣西醫科大學實驗動物中心提供。每籠飼養6 只大鼠，飼養1周，期間自由進食飲水，采用顆粒型普通大鼠飼料喂養，術前禁食不禁水12 h。將54 只SD 大鼠隨機分為假手術組（n=18）和手術組（n=36），手術組制備MCAO 模型，模型制備成功后，將符合標準的大鼠隨機分為模型組和電針組，每組18只。

1.2 主要實驗試劑及儀器

2%TTC 染色液（中國武漢賽維爾科技有限公司）；醫用華佗牌毫針0.3 mm×13 mm、電子針灸治療儀（中國江蘇蘇州醫療用品廠有限公司）；尼氏染色液（中國武漢賽維爾科技有限公司）；4%多聚甲醛緩沖液（中國廣西北一生物科技有限公司）；手術器械（中國上海醫療器械有限公司）；線栓（中國廣州佳靈生物技術有限公司）；3.0縫合線及縫合針（中國廣西北一生物科技有限公司）。

1.3 MCAO模型造模方法

采用Zea 等[8]改良線栓法制備大鼠右側MCAO模型。術前12 h 禁食不禁水，以10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）對大鼠進行腹腔麻醉，待大鼠完全麻醉后，仰臥固定，行頸外側切口，鈍性分離肌肉及筋膜，暴露右側頸總動脈（CCA）、右側頸外動脈（ECA）和右側頸內動脈（ICA），用3.0的縫合線扎緊CCA 和ECA，在ICA 近CCA 的分叉處備線，在距CCA 分叉3～5 mm 處用眼科剪剪一小口，然后將線栓緩緩經CCA 插入ICA，當線端插入ICA 約1.7～2.1 cm（線栓上有一黑點，黑點到分叉即可）時，收緊備線，剪去線栓多余末端，常規用碘伏消毒，縫合頸部皮膚，待大鼠完全清醒后放回籠中，自由進食飲水。MCAO大鼠模型制備成功與否的判定參考Bederson 等[9]4分5級法，即待大鼠麻醉清醒后，在24 h 內有：（1）大鼠左側的上下肢肢體受痛刺激后，肢體不能正常收縮；（2）大鼠不能走直線，并且身體向左傾倒或者向左側轉圓圈；（3）提住大鼠尾巴末端時，左上肢屈曲，不能向前伸直；普遍認為只要大鼠具備以上兩條癥狀表現時，則表明成功制備了MCAO大鼠模型。

1.4 電針治療方法

造模成功24 h后開始對大鼠進行電針治療，取穴：參照華興邦等[10]編制的《大鼠穴位圖譜的研制》定位“內關”、“足三里”兩穴位，具體為取俯臥位固定大鼠，定位大鼠雙側上肢的“內關”穴（前肢內側，離腕關節約3 mm 左右的尺橈骨縫間），雙側下肢“足三里”穴（膝關節后外側，在腓骨小頭下約5 mm處）。以28 號0.5 寸無菌針灸針（13 mm×25 mm）快速直刺入穴位皮膚表層后放手，“內關”穴約刺入3 mm，而“足三里”穴刺入深度約為5 mm。腦梗死電針治療組雙側“內關”穴及“足三里”穴分別接入電子針灸治療儀（蘇州醫療用品有限公司），波形采用疏密波，電流1 mA，刺激頻率為2/15 Hz，以大鼠肌肉輕微抖動，不嘶叫為度。療程：每日治療1 次，每次留針20 min，分別治療3 d、7 d、14 d后取材。假手術組與模型組不給予任何干預措施。

1.5 觀察指標

1.5.1 大鼠神經功能缺損評分 由同一名熟練掌握改良版大鼠神經功能缺損評分的技術員分別對造模成功3 d、7 d、14 d 的大鼠進行評分，主要評分包括提尾實驗（0～3 分），感覺實驗（0～2 分）、行走實驗（0～3分）、平衡木實驗（0～6分）及反射和異?；顒訉嶒灒?～4分），共18分，正常SD大鼠為0分，神經功能缺損評分在1～6 分為輕度損傷，7～12 分為中度損傷，13～18 分為重度損傷，評分越低，代表神經功能缺損程度越輕[11]。

1.5.2 TTC 染色技術檢測腦梗死體積 TTC 染色能夠既直觀又客觀的顯示大鼠腦梗死后腦組織的梗死體積，是用來評價腦缺血損傷程度的常用指標。正常腦組織會被染成鮮紅色，而梗死灶區域腦組織被染成蒼白色。各組在腦梗手術后3 d、7 d、14 d分別隨機抽取大鼠3只，以10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射完全麻醉大鼠后迅速開顱取腦，取出的大腦在-4 ℃的冰箱凍存20 min后，放置在冰面上用刀片垂直切除小腦、嗅球，然后從額極始沿冠狀面垂直將大腦分別切成約2 mm 厚的腦片，切完共6片，以備TTC染色。

1.5.3 尼氏染色觀察腦組織形態 尼氏小體是僅存在于神經元胞體內的嗜堿性顆粒群，它和神經元的功能極為密切，當各種誘發因素導致神經元受損害變性時，尼氏小體顆?？沙霈F數量及位置的變化，呈明顯的溶解或消失。損害消失時，尼氏小體可恢復正常，這說明尼氏小體與神經損害密切相關，因此尼氏小體結構的變化可作為神經元受損的標志。各組在術后3 d、7 d、14 d時分別隨機抽取大鼠3 只，以10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射完全麻醉大鼠后，將針從心尖插入至升主動脈，灌注約100 mL 生理鹽水，使大鼠全身血液排盡，改用冷的4%多聚甲醛約100 mL灌注固定腦組織?？焖贁囝^取腦，將取出的腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，進行脫水、透明、浸蠟、包埋，冠狀連續切片，隨后行尼氏染色，最后在光學顯微鏡下觀察梗死側大腦皮層運動區的病理形態變化。

1.6 統計學方法

采用SPSS 26.0 版軟件進行數據統計與分析。計量資料用均數±標準差（）描述，當滿足正態分布和方差齊性時，兩組比較用獨立樣本t檢驗，多組比較用單因素方差分析；若資料不符合正態分布且方差不齊時，則采用非參數檢驗。計數資料采用百分比或率來描述，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠神經功能缺損評分

術后3 d，電針組、模型組的神經缺損評分最高，在7 d、14 d 時，模型組和電針組的神經功能缺損評分均呈下降的趨勢。與假手術組比較，模型組和電針組在不同時間點的神經功能缺損評分均有顯著的提高（均P＜0.05）；與模型組相比，電針組3 d，7 d神經功能缺損評分無明顯差異（P＞0.05），電針組14 d 的神經功能缺損評分則有明顯的降低（P＜0.05），見表1。

表1 不同時間點各組大鼠神經功能缺損評分比較

表1 不同時間點各組大鼠神經功能缺損評分比較

與假手術組同一時間點比較，*P＜0.05；與模型組同一時間點相比，△P＜0.05。

2.2 大鼠腦梗死體積

電針組大鼠腦組織經TTC染色后，大腦皮層非梗死區域腦組織染色呈鮮紅色，梗死區域腦組織染色呈蒼白色，且梗死灶多分布于皮層感覺運動區；在3 d 時，電針組與模型組腦梗死體積變化差異不顯著（P＞0.05），而電針組7 d 和14 d 的腦梗死體積相較于模型組則有明顯的減?。≒＜0.05），見圖1、圖2。

圖1 TTC染色大鼠電針不同時間點腦梗死體積

圖2 不同時間點各組大鼠腦梗體積百分比

2.3 大鼠腦組織形態學改變

模型組、電針組不同時間點大鼠大腦皮層腦組織經尼氏染色后，模型組與電針組的神經細胞在術后3 d均嚴重腫脹變形，核周的尼氏小體數量減少，大量神經元細胞破碎，胞核分離，模型組與電針組腦組織形態學改變相似；術后7 d，模型組和電針組的神經細胞仍有破碎，細胞腫脹變形，但兩組均出現少量尼氏小體，且電針組尼氏小體數量較模型組多。術后14 d，模型組與電針組尼氏小體數量增多，神經元細胞輕度腫脹，胞核完整，且與模型組相比，電針組神經細胞形態較完整，尼氏小體細胞排列較密集，呈片狀分布，見圖3。

圖3 不同時間點各組大鼠梗死側腦組織尼氏染色（×400）

3 討論

缺血性腦卒中系由各種原因所致的局部腦組織區域血液供應障礙，導致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進而產生臨床上對應的神經功能缺失表現。本實驗采取線栓法制備MCAO模型大鼠，最終使線栓阻斷大腦中動脈的起始端，進而阻斷大腦中動脈的血流供應，造成局灶性腦缺血模型，模擬人體大腦中動脈阻塞型腦缺血過程。研究發現，大腦缺血缺氧之后會激活缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）表達，兩種蛋白被激活后可分別誘導下游的蛋白反應，最終激活細胞的自噬功能，從而清除受損的細胞來維持正常細胞的功能，自噬和凋亡同時發生，加速細胞死亡，減小缺血半暗帶的面積，進而使腦缺血后大腦皮層的梗死體積增大[12]。

本研究中，電針組7 d、14 d 的腦梗體積與模型組相比有明顯的減少，且電針組在7 d、14 d 時尼氏小體數量較模型組有明顯增加，損傷程度較模型組輕，尼氏小體形態也較為完整，排列較模型組密集。同時電針組神經缺損評分在7 d、14 d與模型組相比，下降幅度較大。此時在微觀層面中，電針組尼氏小體增加數量也是多于模型組，形態較完整，排列較緊密，提示電針可以增加腦梗死缺血側大腦皮層的尼氏小體數量，保持其細胞形態的完整，進而對腦梗后大鼠運動功能恢復有促進作用。內關為心包經絡穴，心主神明，心包為心的護衛，代君行令，取內關穴可通竅醒神；心主血脈，取內關穴可通血脈行氣血。足三里為陽明經穴、胃的下合穴，陽明經為多氣多血之經，陽明經氣血通暢，正氣得以扶助，才能使機體功能逐漸恢復[13]。兩穴相配，可起到活血化瘀，舒腦通絡的作用，減輕腦梗死帶來的損害，促進腦梗死后肢體功能恢復。

本次實驗研究發現，電針“內關”、“足三里”可以減小MCAO大鼠梗死側大腦皮層的梗死體積，縮短尼氏小體恢復時間，促進梗死側大腦皮層尼氏小體數量的增加，初步證實隨著梗死側大腦皮層尼氏小體的增加，MCAO 大鼠的運動功能會逐步恢復。然而，由于本課題研究方法和指標局限，樣本量不足，干預周期短，且急性腦梗死機制復雜，影響神經可塑性的因素較繁雜，不能全面的闡述電針治療急性腦梗死的發生機制與作用。將來在人員、時間、資金較為充足的條件下，可進一步探討如：設計樣本量更大，不同電針刺激頻率、不同穴位組合的比較；不同的檢測指標之間的相互關系如何；觀測的時間位點延長，比如延長至4 周甚或1 個月或更長等等，都可以進行深入研究探討，以期為臨床電針治療腦梗死提供更加合理的方案和理論支持。