利用分子標記技術研究甜菜品種細胞質的育性基因型

夏雨晴，張于，吳則東，邳植

（黑龍江大學現代農業與生態環境學院，哈爾濱 150080）

0 引言

植物核質互作型雄性不育（CMS）由線粒體基因組和核基因組共同決定，與花粉不育表型相關，花粉不育表型可被稱為育性恢復基因的核基因（Rf）抑制[1]。CMS是植物的一個重要性狀，目前在150多種植物中均有發現[2]。甜菜是利用CMS雜交種子生產的代表作物[3]。

1945 年，OWEN 提出甜菜細胞質雄性不育（CMS）是由一個不育型細胞質（S）和兩個Rf隱性基因（X 和Z）控制的，其中X 在育性恢復力上強于Z[4]。但他注意到甜菜CMS的表達有時過于復雜，不能用這個簡單的遺傳模型來解釋，因為在雜交試驗的后代中出現了半雄性不育類型。根據OWEN 的遺傳模型，細胞質雄性不育甜菜具有S（xxzz）基因型。為了繁殖不育系，選育了不含恢復等位基因，但細胞質正?？捎员ＷC花粉產生的保持系，即細胞質為N（可育型）細胞核基因為xxzz的類型。在這種雜交育種方法中，最重要的是保持系基因型的鑒定，因為不育系是由保持系與不育系祖先系反復回交而培育的。目前，甜菜雜交育種的一個主要問題就是保持系基因型的稀缺，使得保持系選擇十分困難[5]。常見的甜菜保持系選育方法通常是鑒定法，通過不育株與擬鑒定株成對套袋育種，再根據其F1后代不育株的育性推測擬鑒定株是否具有保持能力。這通常需要4～6 年才能正確判斷，耗時長且效率低。后來程大友等[6]利用以多胚一年生基因型不育系甜菜鑒定選育二年生單胚或多胚基因型保持系，僅需13～16 個月。盡管如此，甜菜不育系和保持系的鑒定與選育依然耗時較長。加快育種周期，早已成為各國育種家共同關注的問題[7]。

隨著分子生物技術的不斷發展，NISHIZAWA 等[8]發現了在甜菜線粒體基因組中的數目可變的串聯重復序列（VNTR）具有多態性和4 個不相關的串聯重復序列位點（TR1、TR2、TR3 和TR4），而其中TR1 串聯重復序列的多態性最高，串聯重復序列的數量為2～13 個不等?？梢岳米饔糜谔鸩司€粒體VNTR 位點進行甜菜細胞質的育性鑒定。CHENG 等[9]通過對中國甜菜種質資源的研究發現，不同細胞質育性類型的小衛星序列的拷貝數具有多態性，其中細胞質為OWEN 不育型的TR1 片段有4 個拷貝，細胞質為保持系型的拷貝數為13 個。王有昭[10]也用此方法對甜菜主要品系進行VNTR分子檢測時，在葉用甜菜中首次發現了一株特異類型細胞質，其TR1片段拷貝數為10個。其余試驗結果與程大友的結果一致，經過測序發現，其TR1不育系擴增條帶大小在500 bp 以下，保持系擴增條帶大小在750 bp 左右。以這兩個作為對照材料進行PCR 擴增，可以通過對比條帶帶型大小的方式來判斷甜菜細胞質類型。

中國并非甜菜的起源國，雖然甜菜作為糖料作物栽培在我國已有100多年的歷史，甜菜育種事業也在不斷發展[11]，但仍然不及歐洲發達國家。目前世界各主要國家使用的甜菜品種大多為單胚細胞質雄性不育雜交的三交種[12]。在中國培育的甜菜品種，幾乎都是與少數國內部分地區種植的自由授粉品種進行雜交而得來的。雜交種子的生產依賴于單一的不育系，即所謂的OWEN 型細胞質，它是由OWEN 在品種‘US-1’中發現的[9]。近年來，國內也育成了一些以甜菜細胞質雄性不育系為母本的單胚品種，但由于我國的單胚不育系和保持系的數量較少，限制了三交種母本的數量，也使得我國每年配制的雜交組合數目遠遠少于國外的育種公司，所以我國主要投入生產的甜菜品種多數引自于國外，而這些品種的育性組成情況我們并不清楚。

目前國外甜菜種業公司在我國占據大部分市場，國產甜菜種子受到國外甜菜種子的沖擊較大[13-14]。隨著單胚雄性不育丸?；贩N的需求量逐年擴大，市場上出現質量下降、假冒、掉包種子等現象；且國外品種的進入也造成我國甜菜褐斑病、叢根病、根腐病等病害加重，導致甜菜含糖率下降，影響了農業綠色生產發展進程，也使國內愈發依賴國外優良抗病品種[15]。為了更好地了解國內外甜菜品種的細胞質組成情況，基于甜菜細胞質線粒體基因組的變異，本試驗以現有的109 個國內外甜菜登記品種的基因組DNA 為模板，利用已開發的作用于甜菜線粒體VNTR 位點的小衛星分子標記TR1 引物[7]，研究目前國內外甜菜品種的細胞質育性基因型，以提高甜菜育種效率，為我國甜菜產業的發展提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

試驗材料為109 個國內外甜菜登記品種，及1 對自主培育的甜菜OWEN 型不育系和保持系作為對照組，共計110 份單株（表2）。所有甜菜品種的種子均由農業農村部全國農業技術推廣服務中心提供。品種種植于黑龍江大學哈爾濱市呼蘭校區試驗田中。有部分發芽率較低的品種，則在黑龍江大學現代農業與生態環境學院的恒溫光培室內補種，待長至1對真葉時即可采集其嫩葉用于DNA提取。

1.1.2 引物

試驗所用引物為鑒定細胞質育性的TR1 引物[7]。引物序列如表1。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 試驗中使用的DNA 標記Table1 DNAmarkers used in the experiment

1.1.3 試驗試劑

1×CTAB 緩沖液、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇、TE 緩沖液、超光速Mix、瓊脂糖粉、1×TAE 溶液、G-Red熒光核酸染料。

1.1.4 試驗儀器

震蕩研磨機、金屬浴鍋、微量分光光度計、PCR儀、低速離心機、高速離心機、凝膠成像儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 CTAB法提取DNA

采用改良的CTAB法[16]提取109 個甜菜品種及保持系（O 型）和不育系（CMS 型）的DNA，每個品種取10株葉片的嫩葉單獨提取DNA。

1.2.2 DNA濃度檢測與稀釋

提取完DNA 后，吸取1 μL DNA 原液，使用微量分光光度計檢測DNA 濃度和OD260/OD280比值。保證OD260/OD280值≥1.8，濃度≥20 ng/μL。將所得的DNA 原液濃度用ddH2O 稀釋為100 ng/μL，將原液放于-20 ℃冰箱中長期保存，再將稀釋液放于4 ℃冰箱中保存，便于隨時取用試驗。

1.2.3 PCR擴增

10μL 的PCR 擴增體系含5μL超光速Mix，0.4μL引物，3.6μL的ddH2O，1μL的甜菜基因組DNA。PCR擴增條件為95 ℃預變性3 min；94 ℃變性25 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸2 min，循環28 次；72 ℃延伸5 min，16 ℃保存。

1.2.4 1%瓊脂糖凝膠電泳及檢測

PCR 擴增結束后，制備1%的瓊脂糖凝膠，每100μL 的瓊脂糖凝膠中加入5μL 的G-Red 熒光核酸染料。在每組樣品中加入保持系（O 型）與不育系（CMS 型）DNA 的PCR擴增結果進行對比，吸取5μL 的PCR 產物進行點樣，而后在130 V電壓下電泳30 min左右。電泳結束后放入凝膠成像儀觀察條帶。

2 結果與分析

2.1 甜菜登記品種的細胞質育性鑒定

利用作用于甜菜線粒體VNTR 位點的細胞質鑒定引物TR1 對甜菜品種的基因組DNA 進行PCR 擴增后，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其育性結果。通過對109 個甜菜登記品種的細胞質基因型進行鑒定，可得知TR1 引物擴增出來的條帶類型主要有500 bp 和750 bp 兩種，即S 型細胞質（細胞質不可育型）和N 型細胞質（細胞質可育型）。對照組中自主培育的‘WZD-5CMS’不育系擴增出的條帶為500 bp，‘WZD-5O’保持系的條帶為750 bp左右。所鑒定的甜菜登記品種的擴增條帶大多是500 bp，如表2所示。只有品種‘新甜15號’、‘ZT6’和‘甜研312’這3 個品種的擴增條帶類型是雜合的，條帶為500 bp 或750 bp。而這3 個品種都是我國自主培育的多胚種。

109個甜菜品種中的部分品種PCR擴增的電泳結果見圖1。在每個品種前用標準的成對不育系（‘WZD-5CMS’自交系）和保持系（‘WZD-5O’自交系）作為對照組，依據對照組的條帶大小可以看出品種‘KUHN814’的1～10 號擴增出的條帶為500 bp，與不育系的條帶一致，則可以認為該品種的細胞質都是S型。品種‘新甜15 號’的1～10 號擴增出的條帶既有500 bp 也有750 bp，則該品種內的細胞質育性類型是雜合的，既有S型也有N型。

圖1 部分甜菜品種的細胞質類型鑒定結果Fig.1 The cytoplasmic type identification results of some sugar beet varieties

所鑒定的109 個供試品種中，106個為S 型細胞質（不育型細胞質），占比97.2%，3 個為既有N 型（可育型細胞質）又有S型細胞質（不育型細胞質），占比2.8%。只有品種‘新甜15號’、‘ZT6’和‘甜研312’這3個品種內部的細胞質育性類型是混雜的，這3個品種都是我國自主培育的多胚種子（見表2）。

表2 供試材料的分子鑒定情況Table 2 Molecular identification of the test material

2.2 國內外甜菜登記品種多樣性以及細胞質育性組成情況分析

如圖2 所示，本次試驗所使用的109個國內外甜菜登記品種中主要都是國外育種公司培育的品種，共有95個，占比為87%。其中自主培育甜菜種子最多的國家是荷蘭，占比高達41%，其次是占比為14%的德國和13%的丹麥。國外的甜菜登記品種都是純合的S型細胞質。

圖2 供試材料的地區分布Fig.2 Regional distribution of test materials

在供試材料中，來自新疆農業科學院經濟作物研究所、黑龍江大學等國內自育的地方品種有14 個，占比約為13%，其中的5個品種為單胚，9個品種是多胚，多胚種子中3個品種的細胞質類型既有S型也有N型。

3 討論與結論

生產具有優良雜種優勢效應的甜菜，需要具有高配合力的基因型進行雜交，配合力往往與基因型的遺傳分化程度有關[17]。隨著時代的發展，甜菜育種工作者們已不再通過挑選表型性狀來進行這種選擇，而是使用分子標記技術[18]。利用分子標記技術，還可以進行相應基因型品種的鑒定[19]。將多個抗性基因聚合到一起，實現聚合育種[20]。用分子標記輔助育種（MAS）的這種方法鑒定出甜菜細胞質基因是N 型還是S型是非常實用有效的方式，代替了常規育種鑒定法，即通過多代的套袋育種，觀察其后代分離情況來判斷擬選的保持系是否具有保持能力。分子標記輔助育種（MAS）為將來利用國外的優良甜菜品種育成能為我們所用的不育系、保持系以及授粉系服務，顯著提高育種選擇工作的準確性和研究效率。

本試驗對現有的大部分甜菜登記品種的細胞質育性進行了鑒定，對照組中的‘WZD-5CMS’自交系為500 bp，即S型細胞質；‘WZD-5O’自交系為750 bp，即N 型細胞質。所鑒定的供試材料中S 型細胞質的比例為97.2%，品種中既有N 型又有S型細胞質比例為2.8%。由此可得，所使用的甜菜登記品種中大部分品種的細胞質是純合的S型細胞質。只有品種‘新甜15號’、‘ZT6’和‘甜研312’這3個品種的細胞質育性類型是雜合的。而這3 個品種都是我國國內自主培育登記的多胚種子。由此可見，國外發達國家使用的基本都是單胚細胞質不育型種子，而我國自主培育使用的仍有多胚種，細胞質育性存在不一致的現象，也說明了種子的一致性較差。從試驗的結果來看，目前國內外甜菜育種所用的親本細胞質育性比較單一，鑒定結果均為OWEN 不育型，一旦產生對OWEN型雄性不育的病害，就會對甜菜產業造成致命的打擊。

今后甜菜育種工作者應以豐產、高糖、抗病為目標，拓寬遺傳基礎[21-22]，注重選育多樣化細胞質不育型的優良單粒種，豐富甜菜種質資源。同時提高品種的純合性水平，母本細胞質需是純合的不育型。建立對應的優質高效的分子標記輔助選育（MAS）體系[23]，加強甜菜抗病基因工程研究，加快甜菜抗病育種進程。本試驗中僅對甜菜登記品種的細胞質育性進行了鑒定，而其核基因是哪種類型還需進一步的驗證，因此，今后還需對甜菜登記品種的細胞核基因類型進行鑒定及研究。