甜菜幼苗對氮脅迫及復氮后的生理生化響應

趙陽，石俊婷，芮秀麗，李佳佳，魏多，劉大麗

（1.國家甜菜種質中期庫，哈爾濱 150080；2.黑龍江大學現代農業與生態環境學院，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜是我國重要的糖料作物，是制糖工業的主要原料之一，其主要種植區分布在東北、華北和西北等地區[1]。甜菜具有較高的營養價值和商用價值，其產量和品質對人類的生活需求和制糖工業的發展有著重要的影響[2]。而甜菜單產低，是制約我國甜菜糖業發展的重要問題之一。

氮是甜菜生長過程中不可替代的重要營養元素，是植物體內蛋白質、核酸、磷脂、生物堿和某些植物生長激素的重要組分之一[3]。氮能夠促進植物新葉生長，增加葉片厚度，增大葉面積[4]。氮素不僅是植物體內葉綠素的重要組成部分，而且氮含量可以通過其他途徑間接影響植物的葉綠素含量和光合作用[5]。研究表明，在甜菜生長的過程中，氮素對甜菜的生長發育、塊根含糖和品質的影響非常之大。當供給不足時，甜菜往往會表現出特定的缺乏癥狀，產量降低，品質下降，限制經濟效益。雖然植物干物質積累量與施氮量呈顯著正相關，但當施氮量超過甜菜最佳生長所需量時，則會導致根中的干物質和蔗糖的含量下降。施氮量與含糖率呈顯著負相關，隨著施氮量的增加，塊根中造蜜性物質、有害氮含量等含量增加使甜菜品質下降，同時細胞滲透壓增大促進對水分的吸收，最終導致甜菜含糖率降低[6-7]。過量氮肥投入還會使生產成本增加，造成氮肥資源浪費和土壤退化等環境風險[8]。因此科學合理施氮對提高甜菜的氮素利用率、降低生態環境污染具有重要意義[9]。合理施氮、按需施氮、提高氮的利用率，是提高甜菜塊根產量，提高經濟效益的有效措施。

在作物生產中，不僅需要關注其葉與根的生物量的積累，還需要關注其體內活性成分在不同氮水平下的變化，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽轉移酶（GST）和過氧化物酶（POD）等。在植物正常生理狀態下，機體產生和清除自由基的速率處于動態平衡狀態[10]。逆境脅迫條件下，植物體內產生的大量活性氧會損傷機體的蛋白質結構、細胞的結構和功能、細胞膜的通透性等[11]?？寡趸赶到y可以有效地清除活性氧，使機體維持穩定。超氧化物歧化酶（SOD）作為重要的抗氧化酶之一，可以有效清除機體內的活性氧、減輕膜質過氧化對機體造成的損傷[12]。研究表明，受到輕度或短期氮脅迫植物的SOD 活性會逐漸增加，受到嚴重或長期氮脅迫的植物SOD 活性會逐漸降低[13]。脯氨酸（Pro）在植物抵抗逆境脅迫過程中起著重要的作用。在如干旱、高溫、高鹽、冰凍、重金屬等逆境脅迫下，植物會在體內積累大量脯氨酸來調節滲透平衡，維持蛋白質、膜和亞細胞結構的穩定[14]。脯氨酸的積累能夠有效緩解逆境脅迫條件對植物抗氧化系統造成的影響和傷害。因此，脯氨酸含量可以作為衡量植物抗性的指標[15]。丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的主要產物，其含量反映出逆境脅迫下植物受害的程度和逆境條件的強弱[16]。在植物受到如氮等脅迫時，植物所產生的自由基會引發膜脂過氧化作用，使丙二醛生成和積累，導致膜的流動性降低，膜的通透性增強。

目前，雖然一些學者對氮素施用量與甜菜的表型和產量等方面的關系進行了研究[6-7]，但鮮少研究和關注甜菜的低氮、缺氮以及復氮生理變化。因此，本試驗分析了氮脅迫對甜菜根和葉中的過氧化物酶（POD）、谷胱甘肽轉移酶（GST）和超氧化物歧化酶（SOD）活性、脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）含量的影響，揭示甜菜的氮脅迫下的應答機制，為氮脅迫生理研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗在黑龍江大學國家甜菜種質中期庫實驗室進行，選取具有發芽率高、顆粒大且飽滿、相對大小一致的種子，幼苗健壯的甜菜資源‘780016B/12優’為材料。

1.2 甜菜培養及氮脅迫處理

將種子在2‰的福美雙溶液中浸泡過夜，蒸餾水沖洗后，用盛有蛭石的培養槽進行為期9 d 的育苗。當兩片子葉展開后，將幼苗移栽到晝夜溫度分別為25 ℃和18 ℃，光照強度為200μmol/(m2·s)，每天連續光照14 h 的條件進行培養。當甜菜幼苗第二對真葉長出時，將幼苗移至缺氮N0（0 mmol/L）、低氮N1.5（1.5 mmol/L）和對照N10（10 mmol/L）的改良Hoagland 營養液中[17]，分別在0、12、24 和48 h 對甜菜幼苗進行生理指標測定。同時，將氮脅迫處理后的幼苗進行恢復供氮，復氮24 h和48 h后，對甜菜幼苗的各生理指標進行測定。

1.3 生理生化指標測定

采用氮藍四唑（NBT）法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性[18]；采用NBT 光還原法測定植物SOD 及SOD標準品酶活性[19]；采用愈創木酚比色法測定過氧化物酶（POD）活性[20]，利用H2O2/過氧化物酶（POD）/愈創木酚（GA）反應產物，在470 nm 的吸光度去定量POD 活性[21]；用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量，用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量[22]；用谷胱甘肽-S轉移酶（GSH-ST）試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定谷胱甘肽轉移酶（GST）。

1.4 數據處理

用Microsoft Excel 2010軟件進行數據處理和作圖（表），用SPSS 23.0軟件進行數據差異及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 缺氮、低氮脅迫和復氮對甜菜脯氨酸含量的影響

與正常供氮培養條件相比，甜菜在缺氮、低氮以及復氮處理后，其體內的各項生理生化指標均產生了不同程度變化。如圖1 所示，甜菜幼苗缺氮和低氮脅迫處理后，根與葉中脯氨酸（Pro）含量先緩慢下降后迅速升高，而后增幅趨于平緩。

圖1 不同氮處理水平對甜菜幼苗體內脯氨酸含量的影響Fig.1 Effect of different nitrogen treatments on proline content in sugar beet seedlings

甜菜幼苗根和葉在N0處理中，脯氨酸（Pro）含量在12 h后開始增加，在處理48 h后與初始時相比分別增加了265.54%和219.24%；與對照組相比分別增加了245.99%和205.57%。在N1.5 處理中，根和葉中脯氨酸含量在48 h 后與初始時相比分別增加了209.04%和178.20%；與對照組相比，分別增加了192.51%和184.15%。復氮后Pro含量變化不明顯，根和葉中脯氨酸含量在N10對照組中均無明顯變化。

2.2 缺氮、低氮脅迫和復氮對甜菜體內丙二醛（MDA）含量的影響

逆境脅迫會對細胞造成膜質過氧化。研究表明，在甜菜幼苗的根與葉中，丙二醛隨著氮處理（N0 與N1.5）時間的增長，其含量也顯著增加；N0處理中，在缺氮、低氮脅迫處理48 h后，根和葉中MDA 的含量與對照組相比分別上升了350.20%和129.17%；N1.5處理中，在處理48 h后，根和葉中MDA 的含量與對照組相比分別上升了325.80%和87.50%；復氮處理后其含量雖上升，但無顯著變化。同一處理條件下不同處理時期MDA 含量存在顯著差異，同一處理時期不同處理條件也存在一定差異。脅迫處理過程中，N0 組幼苗MDA含量大于N1.5組，對照組MDA含量均顯著小于N0、N1.5處理組（圖2）。

圖2 甜菜幼苗在缺氮、低氮和復氮條件下的丙二醛含量Fig.2 The content of malondialdehyde in sugar beet seedlings under nitrogen deficiency,low nitrogen and nitrogen resupply conditions

2.3 缺氮、低氮脅迫和復氮對甜菜體內POD和SOD活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）作為清除氧自由基的關鍵酶，在植物細胞脂膜過氧化過程中發揮著重要作用[23]。在N0和N1.5缺氮、低氮脅迫處理48 h后，甜菜幼苗根和葉中POD 活性均達到了最高值，N0 處理下根和葉中POD 的活性與N10 相比分別增加了214.21%和222.15%，N1.5 處理下根和葉中POD的活性與N10 相比分別增加了153.43%和162.01%。復氮48 h 后甜菜根和葉中POD 活性均有所下降，但仍舊比對照組的活性高（圖3A、B）。

隨著脅迫時間的增加及氮水平的降低，甜菜幼苗根和葉中SOD 活性呈顯著上升趨勢（圖3C、D），在缺氮、低氮脅迫處理48 h后，根和葉中SOD的活性達到了最大值；在N0處理下，根和葉中SOD活性與N10相比分別增加了85.67%和79.17%；在N1.5 處理下，根和葉中SOD 活性與N10 相比分別增加了75.90%和61.45%；在處理48 h 后，缺氮處理比低氮處理對SOD 和POD 活性的影響更大，其中低氮處理下根中SOD 和POD 的活性與缺氮時相比分別低5.27%和19.34%；葉中SOD 和POD 的活性與缺氮時相比分別低9.89%和18.67%（圖3）。在恢復正常供氮后，N0 與N1.5 處理下甜菜幼苗根與葉中的SOD 活性雖然有所降低，但仍然高于正常生長條件下的酶活性。

圖3 不同氮處理水平對甜菜幼苗葉片和根中POD和SOD酶活性的影響Fig.3 Effects of different nitrogen treatments on POD and SOD activities in leaves and roots of sugar beet seedlings

2.4 缺氮、低氮脅迫和復氮對甜菜體內GST活性的影響

由表1可知，缺氮或低氮處理前期（12 h），甜菜幼苗根和葉中谷胱氨肽轉移酶（GST）的含量變化不明顯；隨著缺氮時間的增長，GST 的活性顯著增加，48 h 后，與對照相比，N0 處理甜菜幼苗根和葉中GST 活性分別增加了683.86%和258.23%；N1.5 處理分別增加了475.45%和224.81%?；謴凸┑?4 h，甜菜葉片和根部的GST 活性仍舊有所增加，葉中GST 活性增長速率要高于根部，但都達到了最高值。復氮24 h 后，N0 處理下，甜菜根和葉中GST 的活性較N10 相比分別增加了1175.30%和604.01%；N1.5 處理下，根和葉中GST 的活性較N10 相比分別增加了778.44%和480.21%。在恢復供氮48 h 后，GST活性開始下降，但仍舊比對照組GST活性高。

表1 不同氮處理條件下甜菜體內GST 活性的變化（單位：U/mg prot）Table 1 Changes in GST activity in beets under different nitrogen treatment conditions

3 討論

氮素是植物所需的重要營養物質，在植物生長發育中起到關鍵作用。氮是植物體內許多重要有機化合物的組分，也是遺傳物質的基礎[24]。無論是土壤中的低氮含量或是甜菜品種本身的低氮利用率，均不利于甜菜的生產和該產業的可持續性發展[25]。因此，本試驗試圖通過研究在缺氮和低氮脅迫下，甜菜體內的各項生理指標的變化，以及在復氮后，各指標的的恢復情況，探索甜菜應對氮脅迫的生理機制。

本研究通過對不同濃度氮脅迫處理下的甜菜進行生理生化指標的分析發現：低氮脅迫下，甜菜發生細胞質膜損傷，GST 和POD 的活性不斷增加到較高的水平。植物處于逆境時，細胞內活性氧產生與消除間平衡被破壞，植物開始啟動相應防御系統[18]。SOD、POD、GST 是植物體內主要的ROS 酶促清除系統[26]。低氮脅迫下，甜菜體內含氧自由基含量可能增多，為抵御體內含氧自由基的產生，植物體內的抗氧化酶活性增強[27]，延緩葉片衰老，從而使甜菜更好地適應逆境脅迫[28]。植物中丙二醛（MDA）含量的多少是植物細胞膜受到傷害程度的重要體現，MDA 含量高，說明植物細胞膜質過氧化程度高，細胞膜受到的傷害嚴重[29-30]。低氮脅迫下，甜菜體內MDA 的含量隨著脅迫時間的延長而增加，這與王俊、尹大川等[28-29]的試驗結果相似，MDA 和含氧自由基的積累，會影響甜菜幼苗的生長。脯氨酸（Pro）是植物蛋白質的重要組成成分之一，在植物中以游離態形式廣泛存在。在干旱、鹽堿、高溫、低溫和冰凍脅迫條件下，植物體內的Pro含量會顯著增加，因此，植物體內Pro 的含量在一定程度上反映了植物的抗逆性[31]。甜菜體內Pro 的含量隨著低氮脅迫時間的延長而增多，推測其可能通過細胞質內滲透調節來減緩脅迫環境對植物的傷害。但仍舊無法恢復到正常數值，在一定程度上，對細胞仍有損害。

4 結論

本研究通過在缺氮、低氮和恢復供氮條件下，甜菜幼苗體內重要生理指標的對比研究發現，甜菜幼苗通過提高超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、谷胱甘肽轉移酶（GST）活性以及脯氨酸（Pro）含量來適應氮脅迫，應對由于丙二醛（MDA）含量增高的細胞質膜損傷。而在恢復正常供氮后，甜菜機體的生理活性在短時間內很難恢復到正常水平。