自動膜芯片法檢測植物蛋白飲料源性成分

李羽翡

（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030）

植物蛋白飲品的開發豐富了我國乳制品市場，其因含豐富的蛋白質、氨基酸而受到廣大消費者喜愛[1-2]。隨著食品原料價格的上漲，部分生產企業為了降低生產成本，利用廉價植物原料替代或摻入原產品中，以次充好，例如央視在2018年“3·15”晚會中曝光了多家企業生產核桃露時使用成本較低的其他堅果醬或香精香料代替核桃濃漿。類似行為擾亂了正常的食品加工市場，嚴重危害了廣大消費者的利益[3-6]，且有些消費者對個別植物源性成分存在過敏現象，如果未按事實添加或標注，有可能誘發消費者發生過敏反應，后果不堪設想[7]。

目前針對植物蛋白飲料中源性成分鑒偽的鑒定主要集中于ELISA、色譜和質譜技術以及包括聚合酶鏈式反應PCR、實時熒光定量PCR、微滴數字PCR、凝膠電泳、基因組文庫、DNA條形碼等在內的諸多分子生物學技術[8-16]。膜芯片檢測技術將探針固定在膜表面，利用PCR產物進行雜交形成可視化的斑點，因此具有快速、簡便、高通量、高效率等特點，被越來越多的應用于分子生物學領域。本文采用全自動膜芯片方法，可對9種植物源性成分進行同時檢測，完成了蘭州地區市售24份標識含有胡桃（核桃）、花生、杏仁、榛子、大豆、胡蘿卜等源性成分的核桃露乳、杏仁露、胡蘿卜汁等植物蛋白飲料的源性成分檢測。甘肅省蛋白飲料源性成分鑒定還處于初級階段，本研究針對蘭州地區市售植物源性飲料進行摸底調查，以期為監管部門的日常監管工作提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為市售核桃露、杏仁露、胡蘿卜汁等植物飲品，覆蓋蘭州市70%以上的植物蛋白飲品。采用隨機取樣方法，采集樣品共計26份，每份2瓶，樣品包裝完好，樣品信息如表1所示。

表1 采樣明細表

試劑：Premix TaqTM（Ex TaqTMVersion 2.0）（Ta KaRa）、DNeasy mericon Food Kit（QIAGEN）、50 ml錐形離心管（Axygen）、TE緩沖溶液（Tris-EDTA buffer solutionshangbao上海愛必信）。

1.2 儀器與設備

儀器與設備：PCR儀（S 1000TM）（Bio-rad伯樂）；Nano DropTMOne/One C超微量紫外-可見光分光光度計（Thermo Scientific）；Megafuge 8/8R離心機（Thermo Scientific）；MFS-8系列膜芯片雜交儀器（四川華漢）；臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀H 2500 R）。

1.3 探針引物

本實驗引物探針來源如下：腰果引物探針來源于腰果AnaO3致敏蛋白基因，杏仁來源于杏仁Pru dul基因，大豆來源于大豆lectin基因，開心果來源于開心果18SrRNA與5.8SrRNA基因間區，胡蘿卜來源于胡蘿卜抗凍蛋白基因，榛子來源于oleosin基因，芝麻來源于管家基因2S albumin mRNA，胡桃來源于過敏原蛋白Jug r2基因，內參及探針來源于真核生物18SrRNA基因。采用商品化食源性植物過敏原膜芯片檢測試劑盒（配套儀器-華漢MFS-8系列儀器）。

2 分析方法

2.1 DNA提取與擴增

取40 ml飲料樣品裝入Axygen 50 ml錐形離心管，用高速冷凍離心機13000 rpm離心20 min。使用凱杰深加工食品核酸提取試劑盒提取基因組DNA，用NanoDrop紫外分光光度計測定核酸濃度，DNA的吸光值A260/A280比值介于1.8～2.0才可保證多重PCR反應的擴增效率。

2.2 多重PCR擴增程序

使用華漢MFS-8儀器配套食源性植物過敏原膜芯片檢測試劑盒，反應條件：95℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，68℃15 s（30個循環）；68℃15 s；4℃保溫；總體系為20 μl。

2.3 膜芯片雜交顯色

將2.2階段多重PCR產物95℃變性5 min，置于冰上備用。

按照植物過敏原膜芯片檢測試劑盒的操作步驟，配套華漢MFS-8膜芯片雜交儀器，使用商品化的膜芯片進行去活化、清洗、雜交、孵育、洗膜和顯色操作。

2.4 結果判定

將含有核桃、花生、杏仁、胡蘿卜、芝麻、榛子、大豆、腰果、開心果源性成分的物種樣品進行基因提取和擴增，通過2.1—2.3的操作步驟雜交顯色，進行特異性評估；使用TE緩沖液將上述9份含有源性成分的標準樣品DNA分別稀釋至10 ng、1 ng、0.1 ng、0.01 ng 4個稀釋度測定膜芯片的靈敏度。將市售核桃露（乳）、杏仁露、果仁露、胡蘿卜汁等植物蛋白飲料同樣按2.1—2.3的步驟操作，分別進行雜交顯色，實驗完成后，膜芯片上內參點和陽性對照PC點顯色，陰性對照NC點不顯色，代表結果有效。對照說明書中食源性植物過敏原膜芯片點陣圖進行判讀，探針分布模式如圖1所示。

圖1 探針分布模式圖

3 實驗結果

3.1 特異性驗證

對含有以下9種（核桃、芝麻、花生、杏仁、腰果、榛子、大豆、胡蘿卜、開心果）植物源性成分的物種樣品進行DNA的提取、擴增，以無菌水為空白對照，通過PCR擴增，取擴增產物加樣到膜芯片雜交顯色試劑盒中，儀器操作雜交顯色。結果顯示，9種樣品DNA只與其相對應的特異性源性基因發生顯色反應，均被準確識別，并且雜交點清晰可見，無漏檢、錯檢、多檢現象（圖2）。說明該芯片方法特異性識別能力強，可用于9種源性成分的檢測鑒定。

圖2 9種植物基因膜芯片雜交結果

3.2 飲料樣品膜芯片雜交結果

圖3 為部分飲料的膜芯片雜交結果圖，涵蓋了樣品源性成分檢測的不同結果狀態。1號芯片檢出大豆源性成分；2號芯片既檢出花生源性成分，又檢出榛子源性成分；3號、4號芯片分別檢出核桃和杏仁源性成分；5號芯片檢出胡蘿卜成分；6芯片檢出花生和大豆源性成分；7號芯片僅檢出花生成分；8芯片既檢出杏仁，又檢出大豆成分；9號、10號未檢出源性成分；11號、12號是空白對照。樣品檢測結果如表2所示。

表2 樣品檢測結果統計

圖3 典型樣品膜芯片雜交結果

4 結論與討論

我國進出口行業頒布了9種植物過敏原成分檢測標準，但每一個單一指標就需要一項操作標準，在實際應用中不宜推廣[17-25]。國家總局頒布的補充檢驗方法BJS 201707雖涵蓋4種植物源性成分指標，但仍是單重實時熒光PCR檢測，1次擴增只能判讀1個數據指標，對于大規模的數據篩查十分不利[26]。本試驗采用商品化全自動膜芯片檢測方法，該方法具備檢測速度快、上樣通量大、靈敏度高等特點，適用于9種植物過敏原性成分的同時檢測[7，27-31]。

結果顯示，蘭州市售24份植物飲料中，有2份胡蘿卜汁未檢出植物源性成分，不合格率為7.7%，說明市售飲料中存在原料不實、以次充好的現象。因此，相關監督管理部門應因地制宜，針對不同產品的特點和問題隱患開展監管工作。其余幾種堅果類植物蛋白飲料未發現標簽不實或缺失源性成分的現象，說明本領域內生產企業可以做到規范生產、誠信經營。此外，本次篩查工作只對源性成分進行了檢測，無法確定在標簽標識之外是否添加了其他成分，這方面的工作還需要參考理化相關分析數據。因此，植物源性飲料的檢測工作任重道遠，還需要進一步深入研究。