牛環形泰勒蟲enolase基因的原核表達及生物信息學分析

鄭會珍，普 浩，繆榮浩，甘 露，葛曉敏，巴音查汗，李永暢，郭慶勇

(新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052)

牛環形泰勒蟲病是一種蜱傳性血液原蟲病，由寄生于牛的巨噬細胞、淋巴細胞和紅細胞內環形泰勒蟲(T.annulata)引起，急性感染時可致宿主高熱、貧血、黃疸及體表淋巴結腫大等癥狀[1-2]。小亞璃眼蜱與亞洲璃眼蜱作為媒介蜱導致其發病具有明顯的季節性和地域性[3]。牛環形泰勒蟲病高發病率和高死亡率導致牛產奶量及產肉量降低，給養牛業帶來了嚴重的經濟損失，嚴重阻礙了畜牧業的健康發展[4]。近年來，由于耐藥性寄生蟲的進化和傳播及疫苗的缺乏為寄生蟲病的控制和消除帶來極大挑戰，早發現、早治療是目前解決該病的方法。

烯醇化酶(2-phospho-D-glyceratehydrolyase,enolase)在糖酵解中通過催化2-磷酸甘油酸形成磷酸烯醇式丙酮酸為宿主提供能量。enolase在多種生物體內高度保守[5]，有多種生物學功能，enolase可與纖溶酶原(plasminogen，Plg)、纖維連接蛋白(fibronectin，Fn)結合，從而對宿主產生影響[6]。研究發現，不同位置的enolase可對瘧原蟲產生不同影響，在表面可能參與紅細胞入侵；囊泡內可能參與食物泡形成，而細胞核內的enolase可能在轉錄中發揮作用[7]。enolase可位于卵細胞表面，但配子細胞、配子和受精卵表面不存在。瘧原蟲入侵時，動合子表面的enolase不僅結合蚊子中腸上皮受體來入侵其中腸，且賴氨酸肽段(DKSLVK)可結合動合子表面的纖溶酶原激活寄主纖溶系統來侵染宿主[8]。Sato等[9]發現，enolase也可用于瘧疾免疫診斷。由于enolase的保護性抗原特性[10-12]，對其深入研究可使人們更清楚其在寄生蟲入侵宿主、供能中的相關作用，也為潛在的疫苗候選抗原、診斷治療方法和藥物篩選研究奠定基礎。

本試驗克隆了牛環形泰勒蟲新疆株enolase基因并分析其編碼蛋白質的遺傳進化關系，預測enolase的理化性質、二級結構特點、三級結構模型、亞細胞定位、構建蛋白互作網絡并通過抗原性分析對其理論抗原位點進行標記，以期為后續為牛環形泰勒蟲enolase基因特性、候選疫苗、藥物靶點的相關研究提供思路和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-4T-1(+)表達載體及牛環形泰勒蟲標準陽性、陰性血清均由新疆農業大學動醫學學院寄生蟲實驗室保存；限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；2×TaqMasterMix、大腸桿菌DH5α感受態細胞、pMD19-T載體、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自TIGEN公司；質粒小劑量提取試劑盒購自Omega公司；大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞和蛋白質分子質量標準均購自寶信生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗牛IgG抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 目的基因克隆及測序

參考GenBank中登錄的牛環形泰勒蟲enolase基因序列(登錄號：HQ_646253)和原核表達載體pGEX-4T-1(+)圖譜酶切位點，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物。引物序列為：pGEX4T-1-enolase-F：5′-CGCGGATCCATGCAA-TTTTTAGATTCCAGAGG-3′(下劃線部分為BamHⅠ酶切位點)；pGEX4T-1-enolase-R：5′-CCGCTCGAGCAGCTCTTCTTCGATGC-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點)。使用DNA提取試劑盒提取牛環形泰勒蟲DNA并以其為模板，PCR擴增牛環形泰勒蟲新疆株enolase基因。PCR反應體系13 μL：2×TaqMasterMix 6.5 μL,上、下游引物各0.5 μL，DNA模板 1 μL，ddH2O 4.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，50.75 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸8 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行切膠回收，目的片段連接至pMD19-T載體(pMD19-T-enolase)后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，于37 ℃、180 r/min搖菌1 h后涂布于Amp+的培養板，于37 ℃培養箱培養過夜，挑取單菌落進行菌液PCR鑒定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果在NCBI-BLAST上比對。

1.3 系統進化樹構建

在NCBI中通過BLAST獲得不同物種的enolase蛋白氨基酸序列，如小泰勒蟲(XP_764336)、東方泰勒蟲(XP_009692141)、馬泰勒蟲(XP_004831211)、牛巴貝斯蟲(XP_001611923)、卵形巴貝斯蟲(XP_028865010)、雙芽巴貝斯蟲(XP_012768952)、殘留瘧原蟲(XP_028532717)、岡地弓形蟲(AAG60329)。使用Mega 7.0軟件的最大似然法，將分析重復數設置為1 000，構建系統進化樹。

1.4 enolase重組質粒構建與鑒定

提取pMD19-T-enolase、pGEX-4T-1(+)質粒，用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接，轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，于37 ℃、180 r/min搖菌1 h后涂布于Amp+的培養板，37 ℃過夜培養，挑取單菌落培養后進行PCR、雙酶切鑒定，將陽性菌株(pGEX-4T-1-enolase)送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 enolase重組蛋白誘導條件的篩選

將pGEX-4T-1-enolase菌液于37 ℃、180 r/min在10 mL LB液內擴大培養，當菌液D650 nm值達到0.4～0.6時取1 mL菌液作為誘導前對照樣品，加入1.0 mmol/L IPTG在0～6 h每小時取樣進行誘導時間篩選；加入不同濃度IPTG(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L)進行誘導濃度篩選；確定最佳誘導時間和誘導濃度后在16、25和37 ℃進行誘導溫度篩選。使用SDS-PAGE對篩選的條件進行分析和驗證。

1.6 enolase重組蛋白純化及Western blotting分析

將陽性菌液復蘇后在200 mL LB培養基(Amp+)擴大培養，37 ℃、180 r/min培養2.5 h，待菌液D650 nm值達到0.4～0.6時，取1 mL菌液作為誘導前(0 h)對照，加入0.6 mmol/L IPTG在25 ℃誘導5 h，收集菌液沉淀，超聲破碎，分別收集上清和沉淀進行蛋白可溶性分析，并進行蛋白純化。通過SDS-PAGE鑒定后以牛環形泰勒蟲陽性血清(1∶100)和兔抗GST標簽抗體(1∶2 500)作為一抗、兔抗牛 IgG-HRP(1∶10 000)和羊抗兔IgG-HRP(1∶10 000)作為二抗，經Western blotting鑒定重組蛋白的表達。

1.7 enolase蛋白生物信息學分析

將測序正確的核苷酸序列通過軟件翻譯為氨基酸序列進行生物學信息分析，軟件網站及功能見表1。

表1 生物信息學分析軟件網址及其功能Table 1 Website and function of bioinformatics analysis softwares

2 結 果

2.1 牛環形泰勒蟲enolase基因擴增

牛環形泰勒蟲enolase基因PCR擴增結果見圖1。由圖1可知，獲得大小約為1 248 bp的enolase基因擴增產物，經測序后在NCBI-BLAST比對結果顯示，enolase基因與已發表環形泰勒蟲(GenBank登錄號：HQ_646253)相似性為97.35%。

M，DL2000 DNA Marker；1、2，牛環形泰勒蟲enolase基因；3，陰性對照 M，DL2000 DNA Marker;1 and 2，enolase gene of T.annulata;3，Negative control圖1 牛環形泰勒蟲enolase基因PCR擴增結果電泳圖Fig.1 Electropherogram of PCR amplification results of enolase gene of T.annulata

2.2 牛環形泰勒蟲enolase系統進化樹構建

將牛環形泰勒蟲enolase與其他物種的氨基酸序列進行相似性比對并構建系統進化樹，結果見圖2。由圖2可知，牛環形泰勒蟲enolase與小泰勒蟲(XP_764336)親緣關系較近，與殘留瘧原蟲(XP_028532717)和剛地弓形蟲(AAG60329)親緣關系較遠。

2.3 牛環形泰勒蟲enolase基因表達載體的構建及驗證

使用BamHⅠ、XhoⅠ對pGEX4T-1-enolase重組質粒雙酶切，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小分別為4 969和1 248 bp的酶切片段(圖3)，表明原核表達載體pGEX4T-1-enolase構建成功。

2.4 牛環形泰勒蟲enolase蛋白誘導條件篩選

使用IPTG誘導pGEX-4T-1-enolase重組質粒，結果顯示，在25 ℃、IPTG終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導3 h時可獲得大小約為70 ku的蛋白條帶(圖4)，與預期大小一致。

圖2 基于enolase氨基酸序列構建的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on enolase amino acid sequences

M1，DL8000 DNA Marker；1，pGEX-4T-1-enolase重組質粒；2，pGEX-4T-1-enolase重組質粒雙酶切；M2，DL2000 DNA Marker M1，DL8000 DNA Marker;1，pGEX-4T-1-enolase recombinant plasmid;2，Double enzyme digestion of pGEX-4T-1-enolase recombinant plasmid;M2，DL2000 DNA Marker圖3 pEGX-4T-1-enolase重組質粒酶切驗證Fig.3 Double restrict digestion of pGEX-4T-1-enolase recombinant plasmid

①A，誘導時間優化；B，IPTG誘導濃度優化；C，誘導溫度優化。②M，蛋白質分子質量標準；A1～A7，誘導時間分別為0、1、2、3、4、5和6 h；B1～B7，IPTG誘導濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L；C1，誘導前；C2～C4，誘導溫度分別為16、25和37 ℃ ①A，Optimization of induction time;B,Optimization of induction concentrations of IPTG;C,Optimization of induction temperatures.② M,Protein Marker;A1-A7,The induction time was 0,1,2,3,4,5 and 6 h,respectively;B1-B7,The induced concentrations of IPTG were 0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 and 1.2 mmol/L,respectively;C1,Before induction;C2-C4,The induction temperatures were 16,25 and 37 ℃,respectively圖4 enolase蛋白誘導條件篩選Fig.4 Screening of induction conditions for enolase protein

2.5 牛環形泰勒蟲enolase重組蛋白純化及Western blotting分析

重組蛋白純化后經SDS-PAGE驗證后獲得大小為70 ku的單一目的蛋白(圖5A)，使用超微量分光光度計測定蛋白濃度為0.3 mg/mL。Western blotting結果顯示,enolase可與牛環形泰勒蟲陽性血清、GST標簽發生反應，并在70 ku處出現特異性條帶，陰性血清不反應(圖5B、5C)。

M，蛋白質分子質量標準；1，誘導前；2，誘導后，3，超聲后上清；4，超聲后沉淀；5，純化后蛋白；6，抗GST標簽抗體7，陰性對照；8，牛環形泰勒蟲陽性血清；9，陰性對照 M，Protein Marker;1，Before induction;2，After induction;3，Supernatant after ultrasound;4，Precipitation after ultrasound；5，Purified protein;6，Anti-GST-labeled antibody;7，Negative control;8，Positive serum for Theileria annulata;9，Negative control圖5 enolase蛋白純化(A)及Western blotting(B、C)檢測Fig.5 enolase protein purification (A) and detection by Western blotting (B and C)

2.6 enolase蛋白生物信息學分析

2.6.1 理化性質分析 利用ProtParam程序預測牛環形泰勒蟲enolase蛋白理化性質，推測該蛋白的分子式為C2003H3212N542O615S17，分子質量為45.27 ku,等電點(pI)為5.91；帶正電氨基酸殘基(Arg+Lys)48個，帶負電氨基酸殘基(Asp+Glu)52個，蛋白親水性平均系數(GRAVY)為-0.171，不穩定系數為28.53(<40)，屬于穩定性蛋白。

利用Net-Phos 3.1 Server軟件預測發現，enolase有38個磷酸化位點，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點分別為19、9和10個(圖6A)。TMHMM Server v.2.0、Signal 5.0、ProtScale軟件預測結果顯示，enolase無跨膜區(圖6B)、無信號肽(圖6C)、親水性較好(圖6D)。

A，磷酸化位點預測；B，跨膜區預測；C，信號肽預測；D，親疏水性預測 A，Prediction of phosphorylation site;B，Prediction of transmembrane region;C，Prediction of signal peptide;D，Prediction of hydrophilicity and hydrophobicity圖6 enolase蛋白生物信息學分析Fig.6 Bioinformatics analysis of enolase protein

2.6.2 蛋白結構預測分析 利用SOPMA軟件預測牛環形泰勒蟲enolase蛋白的二級結構，其中α-螺旋、無規則卷曲、延伸鏈和β-轉角占比分別為43.03%、33.17%、15.63%和8.17% (圖7)。

使用SWISS-MODEL軟件預測牛環形泰勒蟲enolase蛋白的三級結構(圖8)，模板號為2akm.1.A，全局模型質量估計(global model quality estimation，GMQE)值為0.86，表明構建的模型合理。

線條由長到短分別代表α-螺旋、無規則卷曲、延伸鏈、β-轉角 The lines represent alpha helix,random coil,extended strand and beta turn from long to short圖7 enolase蛋白二級結構預測Fig.7 Prediction of secondary structure of enolase protein

2.6.3 抗原位點預測 用Vaxijen 2.0 在線服務器預測enolase抗原性，默認閾值為0.4時預測結果0.4503，表明 enolase蛋白具有較高的抗原性。由IEDB Analysis Resource預測enolase編碼的氨基酸序列有17個抗原表位(表2)。將表中的抗原位點使用EzMol程序進行標記，結果如圖9所示。

A，骨架式模型；B，卡通式模型；C，空間式模型。圖9同 A，Skeleton model;B，Cartoon model;C，Spatial model.The same as fig.9圖8 enolase蛋白三級結構預測Fig.8 Prediction of tertiary structure of enolase protein

表2 enolase編碼氨基酸抗原表位預測Table 2 Prediction of epitopes of amino acids encoded by enolase

圖9 enolase基因編碼氨基酸抗原位置標記Fig.9 Amino acid antigen location marker encoded by enolase gene

2.6.4 亞細胞定位 通過WoLF PSORT軟件亞細胞定位預測發現，enolase蛋白位于細胞各成分的可能性為細胞質22%、核糖體5%、細胞核3%、細胞外1%、溶酶體1%，初步預測了enolase蛋白發揮功能的位置，也與之參與糖酵解的功能相印證。

2.6.5 蛋白互作網絡分析 通過STRING在線數據庫構建蛋白互作網絡，從而預測出與enolase蛋白發生相互作用的蛋白。由圖10可知，能與enolase蛋白發生互作的蛋白主要有磷酸甘油酸激酶(PGK)、磷酸甘油酸變位酶(PGAM)、二磷酸核苷激酶(NDK)、熱休克蛋白70(HSP70)等。主要參與的生物過程為糖酵解、糖異生、葡萄糖代謝過程、小分子分解代謝、合成等過程，還具有催化活性和結合分子的功能。

圖中兩個GAPDH為序列及長度均不相同的旁系同源 The two GAPDH in the figure are paralogs with different sequences and lengths圖10 enolase蛋白互作網絡圖Fig.10 Protein-protein interaction network of enolase protein

3 討 論

據估計，全世界約有2.5億頭牛面臨感染蜱傳環形泰勒蟲的風險[13-14]。然而，目前存在的治療性化合物布帕伐醌(Buparvaquone，商品名稱為Buparvex)暴露于空氣中易失效[15]，且受限于需早期治療動物疾病。此外，也有關于環形泰勒蟲耐藥菌株的報道[16]，因此，尋找新方法預防泰勒蟲非常重要。

enolase是在原核生物和真核生物[17]中被鑒定為糖酵解過程中產生ATP的關鍵酶，通過參與細胞的產能過程，從而影響細胞的生命活動。通過基因組測序發現，頂復門寄生蟲缺少參與三羧酸循環和β-氧化途徑所需酶的基因序列，所以頂復門原蟲(Theileriaspp.)主要通過糖酵解生成ATP[18]。本研究通過對enolase基因進行擴增，獲得了大小為1 248 bp的擴增產物，其與已發表的環形泰勒蟲(GenBank登錄號：HQ_646253)相似性為97.35%。成功構建分子質量大小為70 ku的enolase重組蛋白，且以包涵體形式表達。該蛋白與Cayir等[19]構建的環形泰勒蟲His-enolase融合重組蛋白可溶性相似，本試驗篩選蛋白表達條件發現enolase蛋白可在低溫、低劑量誘導劑或短時間內產生高于正常的表達量，其可溶性不隨之產生改變，但Cayir等[19]發現降低溫度和濃度可改變蛋白的可溶性，可能是由于標簽不同影響蛋白的可溶性。Western blotting結果顯示，純化后的重組融合蛋白enolase與牛環形泰勒蟲陽性血清及GST標簽抗體發生反應，說明該蛋白有較好的反應原性。

磷酸化是一種普遍存在的翻譯后修飾(post-translational modified，PTM)類型，是由磷酸基團與氨基酸殘基(絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)和酪氨酸(Y))結合所引起的反應[20]。這些特定的殘基在分子水平上表現出不同的功能，相應產生的磷酸化反應也調節著一些生命活動，如細胞周期控制、信號轉導、蛋白質間的相互作用等過程，且識別磷酸化位點有助于揭示磷酸化相關生物過程的分子機制[21]。本研究預測牛環形泰勒蟲enolase蛋白有38個磷酸化位點，主要由蛋白激酶C/A(PKC/PKA)、肌酸激酶Ⅱ/Ⅰ(CKII/CKI)、cdc2構成，enolase可能通過磷酸化過程從而影響細胞的部分生命活動。如Leykauf等[22]在2010年發現惡性瘧原蟲的頂端膜抗原1(apical membrane antigen-1，AMA1)的第610位氨基酸受環單磷酸腺苷(cAMP)調節的蛋白激酶A(PKA)控制絲氨酸磷酸化，若絲氨酸突變為丙氨酸則會導致磷酸化修飾失敗，從而影響蟲體入侵過程。

不同構型、位置和數量使蛋白表現不同的功能[23]。α-螺旋參與構成蛋白質骨架，所以結構穩定、難以形成表位嵌合抗體，但無規則卷曲及β-轉角則不同，位于蛋白表面，排列松散，易彎曲、折疊，所以能形成很好的抗原表位[24]。本研究預測發現，牛環形泰勒蟲enolase蛋白二級結構中α-螺旋與無規則卷曲的占比較大，而且通過預測enolase抗原表位、構建可信的三級結構及抗原標記發現，抗原位點大多位于表面，可能有利于宿主免疫系統識別和捕捉。蛋白質的亞細胞定位可初步預測蛋白在細胞中所處的位置進而分析其功能[25]，本研究預測enolase主要存在于細胞質(22%)，其次是核糖體(5%)，該結果與enolase蛋白糖酵解相關功能相一致。

在蛋白互作網絡中，每個蛋白都具有不同的特征，包括氨基酸序列、亞細胞位置和蛋白質結構域。本研究通過STRING構建牛環形泰勒蟲enolase蛋白的互作蛋白網絡，預測網絡顯示，enolase蛋白與PGK、PGAM、NDK、HSP70等存在相互作用。Paludo等[26]分析蛋白互作網絡表明，enolase是網絡中的一個中心節點，除了與糖酵解和能量代謝相關的蛋白典型相互作用外，也是與不同生物過程(如轉錄、發育和凋亡等)相關的蛋白簇的一部分。Didiasova等[27]和Perconti等[28]在心肌細胞中證明，enolase-1與HSP70、α-enolase與HSPA8的相互作用可對其產生抗氧化應激的保護。本研究的蛋白預測網絡分析可為enolase蛋白參與細胞供能、抗氧化應激提供數據參考。

4 結 論

本研究成功克隆出新疆牛環形泰勒蟲enolase基因，構建原核表達載體pGEX-4T-1-enolase，Western blotting結果顯示該蛋白有較好的反應原性。生物信息學預測分析enolase蛋白可能為穩定性親水蛋白，有38個磷酸化位點、17個抗原表位，主要位于細胞質，與糖酵解相關基因PGAM及Hsp70家族存在互作。