前列地爾通過下調TRIM8表達激活Nrf2/ARE通路抑制心肌缺血再灌注損傷

鄭偉民，詹智暉，吳鐘偉，劉超權，陳運起，李堪董

缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)是世界范圍內主要的死亡原因之一，每年死亡率為2%～3%[1]。目前的醫學干預措施包括經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)或冠狀動脈旁路移植術，可改善心臟的血液供應[2]。然而，心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)引起的不可逆性損傷，在充分的血運重建后，可能作為心絞痛的癥狀出現。超過50%的IHD病人在PCI治療后心絞痛癥狀復發，大多數病人在冠狀動脈旁路移植術后10～15年都有心絞痛復發[3]。因此，需要開發新的治療藥物抑制心肌I/R損傷，以改善IHD的臨床治療現狀。三結構域8(tripartite motif 8，TRIM8)是TRIM蛋白家族的成員之一。研究表明，TRIM8參與腦I/R損傷的發生發展，敲除TRIM8通過抑制炎癥反應和細胞凋亡，對腦I/R損傷具有神經保護作用[4]。NFE2L2基因編碼的核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是氧化還原敏感的主要轉錄因子，對解毒和抗氧化酶基因的表達是必不可少的[5]。已有研究表明，激活Nrf2/抗氧化元件(anti-oxidant element，ARE)通路可抑制缺氧/復氧(hypoxia-reperfusion，H/R)誘導的心肌細胞凋亡和活性氧(ROS)的產生[6]。前列地爾也稱為前列腺素E1(prostaglandin E1，PGE1)，具有擴張血管、抑制血小板聚集的作用，可降低冠狀動脈造影和PCI病人造影劑腎病的發生率[7]。已有研究表明，前列地爾在脂多糖誘導的心肌細胞損傷中發揮保護作用[8]。目前，關于前列地爾對心肌H/R損傷的作用機制尚不明確。本研究旨在探究前列地爾對心肌H/R損傷的作用及其對H/R損傷心肌細胞中TRIM8表達和Nrf2/ARE通路的影響，以期為明確前列地爾對心肌H/R損傷的作用機制及開發新的心肌H/R損傷治療策略提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 12只新生無特定病原體(SPF)級SD大鼠，1～3日齡，8～15 g，雌雄不限；5-BrdU購自美國MedChemExpress；前列地爾購自北京泰德制藥股份有限公司；TRIM8過表達載體(oe-TRIM8)及其陰性對照(oe-NC)購自武漢金開瑞生物工程有限公司；LipofectamineTM2000購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；CCK-8檢測試劑盒購自日本同仁化學研究所；ROS檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；D-Hank′s液和膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢普諾賽生命科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；α-actin、TRIM8和Nrf2抗體購自英國Abcam；醌氧化還原酶1(NQO-1)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology。

1.2 原代心肌細胞的分離和培養 參考文獻[9]進行原代心肌細胞的分離和培養。乳鼠頸部脫臼致死，開胸取心臟。剔除周圍結締組織，D-Hank′s液漂洗心臟，將心臟剪碎后，加入0.25%胰酶液于37 ℃培養箱中消化心臟組織，每次消化5 min，共消化8次。每次消化后取上清液，加入等量含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培養基終止消化。細胞過200目細胞篩，800 r/min離心5 min收集細胞沉淀。含10% FBS的DMEM培養基重懸細胞，將細胞懸液接種至培養皿中，細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱中40 min，差速貼壁分離心肌細胞，去除成纖維細胞，重復該步驟1次。吸取未貼壁的細胞，接種于6孔板，加入0.1 mmol/L的5-BrdU抑制成纖維細胞生長，細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養48 h。第3天去除5-BrdU繼續培養，細胞每2 d更換1次新鮮培養基。

1.3 臺盼藍染色法檢測心肌細胞存活率 差速貼壁分離心肌細胞后，用含10%FBS的DMEM培養基重懸細胞，調整細胞密度至1×106個/mL，細胞懸液和臺盼藍溶液以9∶1比例混合均勻，細胞計數儀進行細胞計數。死細胞呈藍色著染，活細胞無染色。細胞存活率=活細胞數/細胞總數×100%。

1.4 間接免疫熒光檢測心肌細胞標志物α-actin表達 棄去心肌細胞舊培養基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞，加入4%多聚甲醛室溫固定細胞10 min。PBS清洗細胞，加入0.1%TritonX-100穿透15 min；PBS清洗細胞，5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30 min。加入α-actin抗體(1∶200)4 ℃條件下孵育過夜；PBS清洗細胞，加入熒光二抗(1∶500)室溫孵育1 h；PBS清洗細胞，4′-6-二胱基-2-苯基吲哚(DAPI)染核10 min；PBS清洗細胞，熒光顯微鏡觀察。α-actin陽性呈綠色熒光，DAPI染核呈藍色熒光。

1.5 流式細胞術檢測心肌細胞標志物α-actin陽性表達率 收集心肌細胞，PBS清洗細胞后，加入4%多聚甲醛室溫固定細胞10 min。PBS清洗細胞，加入0.1% TritonX-100穿透15 min；PBS清洗細胞，5%BSA室溫封閉30 min。加入α-actin抗體(1∶200)4 ℃條件下孵育2 h；PBS清洗細胞，加入熒光二抗(1∶500)4 ℃條件下孵育30 min；PBS清洗并重懸細胞，上流式細胞儀檢測。

1.6 心肌細胞分組給藥及H/R處理 將對數期生長的心肌細胞接種于6孔板，每孔細胞量為5×105個。細胞置于37 ℃、5%CO2和95%O2培養箱中培養24 h后，將其隨機分為對照組、H/R組、前列地爾組(加入40 μg/L前列地爾)、前列地爾+oe-NC組(加入40 μg/L前列地爾和轉染oe-NC)和前列地爾+oe-TRIM8組(加入40 μg/L前列地爾和轉染oe-TRIM8)。根據分組，按照LipofectamineTM2000說明書所示，進行oe-NC和oe-TRIM8的轉染。細胞繼續培養48 h后，按照分組向細胞中添加前列地爾，細胞繼續培養24 h。除對照組外，其余組根據參考文獻[10]所示，進行H/R處理。將細胞培養基更換為無血清和無糖的DMEM培養基，在37 ℃、94%N2、5%CO2和1%O2培養箱中培養4 h后，將細胞培養基更換為含10% FBS的DMEM培養基，細胞置于37 ℃、5%CO2和95%O2培養箱中培養6 h后，進行后續實驗操作。

1.7 CCK-8檢測細胞增殖

1.7.1 前列地爾給藥濃度測定 將對數期生長的心肌細胞接種于96孔中，每孔細胞數量為5×103個。細胞置于37 ℃、5%CO2和95%O2培養箱中培養24 h 后，將細胞隨機分為0 μg/L組、5 μg/L組、10 μg/L組、20 μg/L組、40 μg/L組、80 μg/L組和160 μg/L組，按照分組，向細胞中添加不同濃度前列地爾，細胞繼續培養24 h后，向每孔細胞中加入10 μL CCK-8溶液，將96孔板置于37 ℃培養箱中孵育4 h，用酶標儀測定各孔在450 nm處的光密度(OD)值。細胞增殖(%)=不同濃度給藥組OD450/0 μg/L組OD450×100%。

1.7.2 各組細胞活力檢測 將對數期生長的心肌細胞接種于96孔中，每孔細胞數量為5×103個。細胞置于37 ℃、5%CO2和95%O2培養箱中培養24 h 后，參照方法1.6對心肌細胞進行處理。向每孔細胞中加入10 μL CCK-8溶液，將96孔板置于37 ℃培養箱中孵育4 h，用酶標儀測定各孔在450 nm處的光密度(OD)值。細胞增殖(%)=處理組OD450/對照組OD450×100%，或者是細胞增殖(%)=處理組OD450/H/R組OD450×100%。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡 按照方法1.6所示，對心肌細胞進行分組給藥及H/R處理。收集心肌細胞，預冷PBS清洗細胞。向細胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液，重懸細胞，調整細胞濃度至1×106個/mL。取100 μL細胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻后，室溫避光孵育15 min。隨后，加入400 μL 1×Binding buffer工作液，混勻后，立即用流式細胞儀檢測。

1.9 流式細胞術檢測ROS產生 按照方法1.6所示，對心肌細胞進行分組處理。收集心肌細胞，加入1 mL 10 μmol/L的DCFH-DA重懸細胞。細胞懸液置于37 ℃培養箱內孵育20 min。用無血清DMEM培養基清洗細胞后，加入PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測。

1.10 蛋白質印跡法(Western Blot)檢測TRIM8、Nrf2和NQO-1蛋白表達 按照方法1.6所示，對心肌細胞進行分組處理。收集心肌細胞，加入蛋白裂解液冰上裂解細胞30 min。4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液。按照BCA試劑盒說明書所示進行上清液蛋白濃度的檢測。取30 μg蛋白加入凝膠中，進行電泳操作。電泳結束后，應用濕轉法將凝膠中的蛋白質轉印至PVDF膜上。5%BSA室溫下封閉PVDF膜3 h。隨后加入TRIM8抗體(1∶2 000)、Nrf2抗體(1∶2 000)、NQO-1抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶5 000)，4 ℃條件下孵育過夜。特異性二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。向PVDF膜均勻滴加電化學發光(ECL)試劑，暗室曝光。Image J軟件進行蛋白條帶的灰度分析。

2 結 果

2.1 原代乳鼠心肌細胞的鑒定 臺盼藍染色結果顯示，心肌細胞存活率為(95.67±2.13)%。間接免疫熒光和流式細胞術結果顯示，心肌細胞中α-actin呈陽性表達。詳見圖1。

圖1 原代乳鼠心肌細胞的鑒定

2.2 前列地爾對H/R心肌細胞增殖和凋亡的影響 CCK-8檢測前列地爾對心肌細胞的安全濃度，結果顯示，前列地爾在80 μg/L和160 μg/L濃度下可顯著抑制心肌細胞增殖(P<0.05)，因此，后續實驗中，前列地爾使用濃度為40 μg/L。CCK-8檢測前列地爾對H/R心肌細胞增殖的影響，結果顯示，與對照組相比，H/R組心肌細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)；與H/R組相比，前列地爾組心肌細胞增殖能力明顯升高(P<0.05)。流式細胞術檢測心肌細胞凋亡結果顯示，與對照組相比，H/R組心肌細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與H/R組相比，前列地爾組心肌細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。詳見圖2。

與0 μg/L組比較，＊P<0.05；與對照組比較，#P<0.05；與H/R組比較，&P<0.05。

2.3 前列地爾對H/R心肌細胞ROS產生的影響 流式細胞術檢測前列地爾對H/R心肌細胞ROS產生的影響，結果顯示，與對照組相比，H/R組心肌細胞中ROS+細胞率明顯升高(P<0.05)；與H/R組相比，前列地爾組心肌細胞中ROS+細胞率明顯降低(P<0.05)。詳見圖3。

與對照組比較，＊P<0.05；與H/R組比較，#P<0.05。

2.4 前列地爾對TRIM8表達和Nrf2/ARE通路的影響 Western Blot檢測前列地爾對TRIM8表達和Nrf2/ARE通路的影響，結果顯示，與對照組相比，H/R組心肌細胞中TRIM8、Nrf2和NQO-1蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與H/R組相比，前列地爾組心肌細胞中TRIM8蛋白表達明顯降低，Nrf2和NQO-1蛋白表達明顯升高(P<0.05)。詳見圖4。

與對照組比較，＊P<0.05；與H/R組比較，#P<0.05。

2.5 過表達TRIM8部分逆轉前列地爾對H/R心肌細胞增殖和凋亡的影響 Western Blot檢測心肌細胞TRIM8的表達，結果顯示，與H/R組相比，前列地爾組心肌細胞中TRIM8蛋白表達明顯降低(P<0.05)；前列地爾組和前列地爾+oe-NC組心肌細胞中TRIM8蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)；與前列地爾+oe-NC組相比，前列地爾+oe-TRIM8組心肌細胞中TRIM8蛋白表達明顯升高(P<0.05)。詳見圖5。

與H/R組比較，＊P<0.05；與前列地爾+oe-NC組比較，#P<0.05。

CCK-8檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡，結果顯示，與H/R組相比，前列地爾組心肌細胞增殖能力明顯升高(P<0.05)，細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；前列地爾組和前列地爾+oe-NC組心肌細胞增殖和凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)；與前列地爾+oe-NC組相比，前列地爾+oe-TRIM8組心肌細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)，細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。詳見圖6。

2.6 過表達TRIM8部分逆轉前列地爾對H/R心肌細胞ROS產生的影響 流式細胞術檢測心肌細胞ROS的產生，結果顯示，與H/R組相比，前列地爾組心肌細胞中ROS+細胞率明顯降低(P<0.05)；前列地爾組和前列地爾+oe-NC組ROS+細胞率比較差異無統計學意義(P>0.05)；與前列地爾+oe-NC組相比，前列地爾+oe-TRIM8組心肌細胞中ROS+細胞率明顯升高(P<0.05)。詳見圖7。

與H/R組比較，＊P<0.05；與前列地爾+oe-NC組比較，#P<0.05。

與H/R組比較，＊P<0.05；與前列地爾+oe-NC組比較，#P<0.05。

2.7 過表達TRIM8部分逆轉前列地爾對H/R心肌細胞Nrf2/ARE通路的影響 Western Blot檢測心肌細胞中Nrf2和NQO-1的表達，結果顯示，與H/R組相比，前列地爾組心肌細胞中Nrf2和NQO-1蛋白表達比較明顯升高(P<0.05)；前列地爾組和前列地爾+oe-NC組心肌細胞中Nrf2和NQO-1蛋白表達比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；與前列地爾+oe-NC組相比，前列地爾+oe-TRIM8組心肌細胞中Nrf2和NQO-1蛋白表達明顯降低(P<0.05)。詳見圖8。

與H/R組比較，＊P<0.05；與前列地爾+oe-NC組比較，#P<0.05。

3 討 論

H/R是許多病理生理過程中細胞損傷和組織損傷的重要原因，包括缺血綜合征、I/R和腦卒中[11]。早期再灌注治療是目前急性心肌梗死病人的標準治療方法。然而，心肌I/R會進一步加劇心肌細胞損傷，從而導致心臟疾病[12]。因此，如何減輕心肌I/R損傷是IHD治療的關鍵。

心肌I/R損傷是一個非常復雜的病理生理過程，包括離子蓄積、線粒體功能障礙、ROS形成、氧化應激和炎癥的激活以及細胞凋亡等[13]。靶向抑制心肌細胞凋亡和ROS的產生，對再灌注損傷具有保護作用[14]。前列地爾是廣泛存在于生物體內的生物活性物質，具有改善血流動力學和血液流變學、降低血脂和血黏度、改善微循環，等作用[14]。已有證據表明，前列地爾可改善自主循環，恢復大鼠腎微血管內皮細胞H/R損傷，抑制炎癥反應[15]。此外，在肝臟I/R損傷的相關研究中，前列地爾也發揮著保護作用。前列地爾通過改善肝臟微循環，減少氧化應激損傷，減少肝內中性粒細胞浸潤和肝細胞凋亡，保護肝臟免受I/R損傷[16]。目前，已有相關的研究證明，前列地爾可明顯抑制H/R損傷誘導的心肌細胞毒作用和細胞凋亡，在心肌細胞H/R損傷中發揮保護作用[17]。本研究以原代乳鼠心肌細胞為研究對象，探討前列地爾對H/R處理的心肌細胞的影響，結果顯示，H/R可誘導心肌細胞凋亡和ROS產生，抑制細胞增殖。而前列地爾給藥處理可明顯抑制H/R處理的心肌細胞凋亡和ROS產生，促進細胞增殖。本研究結果表明，前列地爾在心肌H/R損傷中發揮保護作用。

TRIM8基因位于染色體10q24.3上，廣泛表達于肺、腸、腎、腦和胎盤等多種組織中。TRIM8參與細胞存活、分化、炎癥、先天免疫反應、細胞凋亡等多種生物學過程[18]。已有研究表明，TRIM8參與多種組織I/R損傷過程，例如，肝臟I/R損傷后，TRIM8在肝臟中的表達上調。TRIM8基因敲除可減輕I/R引起的肝細胞損傷，抑制肝臟炎癥反應和細胞凋亡[19]。TRIM8可促進心肌I/R損傷。在H/R處理的心肌細胞中，TRIM8表達上調。TRIM8基因敲除可以提高H/R刺激的心肌細胞的存活率。此外，TRIM8基因敲除抑制了ROS的產生，提高了超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的水平，抑制了心肌細胞凋亡[20]。本研究結果顯示，H/R可誘導心肌細胞中TRIM8蛋白表達，而前列地爾給藥處理可抑制H/R損傷心肌細胞中TRIM8蛋白表達。進一步實驗結果表明，過表達TRIM8可部分逆轉前列地爾對H/R損傷心肌細胞的保護作用，促進細胞凋亡和ROS產生，抑制細胞增殖。本研究結果表明，前列地爾通過上調TRIM8表達，在心肌H/R損傷中發揮保護作用。

Nrf2是保護哺乳動物細胞免受氧化和親電應激的最重要的轉錄因子之一。在氧化應激條件下，Nrf2從Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Kelch sample related protein-1，Keap1)復合體中釋放出來，轉移到細胞核，誘導一系列抗氧化和解毒基因的轉錄，最終導致防御系統的激活[21]。研究表明，H/R可誘導肝細胞中Nrf2/ARE信號通路的激活，而燈盞乙素通過進一步激活Nrf2/ARE信號通路抑制細胞凋亡和氧化應激，減輕肝細胞H/R損傷[22]。目前的證據顯示，在缺氧-葡萄糖剝奪/復氧(oxygen-glucose deprivation/re-oxygenation，OGD/R)處理的神經元中，TRIM8的表達上調，Nrf2/ARE通路被激活。敲除TRIM8可以提高OGD/R暴露的神經元的存活率，減少細胞的凋亡和ROS的產生。此外，敲除TRIM8還進一步激活了Nrf2/ARE通路，沉默Nrf2明顯減弱了敲低TRIM8介導的神經保護作用[23]。此外，已有相關研究證明，前列地爾通過激活Nrf2信號通路，抑制氧化應激，減輕心肌細胞凋亡，在冠狀動脈微栓塞術所致心肌損傷中發揮保護作用[24]。本研究結果顯示，H/R可誘導心肌細胞中Nrf2和通路下游因子NQO-1的表達上調，而前列地爾可進一步上調H/R處理的心肌細胞中Nrf2和NQO-1的表達蛋白。此外，過表達TRIM8可部分逆轉前列地爾對H/R處理的心肌細胞Nrf2/ARE通路的影響，下調Nrf2和NQO-1蛋白表達。本研究結果表明，前列地爾可能通過下調TRIM8的表達激活Nrf2/ARE通路，在心肌H/R損傷中發揮保護作用。

綜上所述，前列地爾可能通過下調TRIM8的表達激活Nrf2/ARE通路，抑制H/R誘導的心肌細胞凋亡和ROS產生，促進心肌細胞增殖，從而在心肌H/R損傷中發揮保護作用。本研究為明確前列地爾對心肌I/R損傷的作用機制及開發新的心肌I/R損傷治療策略提供了新的依據。