廣西毛冬青根對放射腦損傷小鼠認知功能障礙的改善作用及其機制研究*

張馨月，李 婷，何改改，滕雨夢，黎 瑩，王紹軍，韋 力△

（1.廣西醫科大學基礎醫學院，南寧 530021；2.廣西醫科大學第一臨床醫學院，南寧 530021；3.廣西壯族自治區婦幼保健院，南寧 530005）

頭頸部腫瘤作為危害人類健康的主要疾病之一，其發病率位于全球惡性腫瘤的前列，占所有癌癥總人數的5.3%[1]。目前，臨床上常采用放射治療作為頭頸部腫瘤主要的治療方法，在提高患者生存率的同時，也帶來了許多并發癥，如頭痛、惡心、口干、記憶功能減退等，其中，認知障礙是頭頸部腫瘤放療后嚴重并發癥，很大程度上影響患者的生活質量，但目前其具體發病機制尚未明確[2]。膠質纖維酸性蛋白（GFAP）是星形膠質細胞特異性標志蛋白，抗離子鈣結合銜接分子1（Iba-1）是小膠質細胞特異性標志物，在腦損傷狀態下，星型膠質細胞和小膠質細胞被激活，星型膠質細胞GFAP 表達和小膠質細胞Iba-1表達增強[3-5]。本課題組前期研究表明，放射可以促進小鼠海馬區星型膠質細胞和小膠質細胞活化，同時發現放射誘導活化的膠質細胞在認知功能障礙發生、發展和轉歸中起重要作用[6]，雖然其機制尚未清楚，但也為防治放射腦損傷提供新的途徑。

廣西毛冬青（Ilex pubescens Hook.et Arn.var.kwangsiensis Hand-Mazz）為本屬植物毛冬青變種，主產于廣西百色和凌云，具有舒張血管、清熱解毒、抗血栓及抗炎等作用[7-8]。有研究表明，毛冬青能夠減輕炎癥反應，緩解神經細胞水腫，對腦缺血梗死損傷起到保護作用[9-10]。然而，毛冬青是否能夠通過調節膠質細胞活性及狀態，改善放射誘導的認知功能障礙，目前鮮少報道。本研究通過建立放射性腦損傷小鼠模型，探討廣西毛冬青根對放射性腦損傷學習記憶的影響及其機制，為臨床防治放射帶來的認知功能損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性昆明小鼠100 只，5 周齡，體重（25±3）g，購于廣西醫科大學實驗動物中心，動物生產許可證號為SCXK（桂）2014-0002。所有小鼠飼養于廣西醫科大學動物房，予以標準飼料喂養，溫度為（25±2）℃，12 h 明暗交替，自由飲水和攝食，適應性飼養1 周后進行實驗。本實驗按照《國家衛生研究院實驗動物關愛與使用指南》進行。

1.2 主要試劑與儀器

毛冬青湯劑由廣西壯族自治區婦幼保健院提供；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒、蘇木精—伊紅（HE）染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；Iba-1 抗體、GFAP 抗體均購于Abcam 公司。Morris水迷宮購于中國科學研究院；60Co 治療儀由廣西醫科大學第一附屬醫院提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型與分組 將100只雄性昆明小鼠隨機分為4組：對照組、毛冬青組、放射組和放射+毛冬青組，每組25 只。毛冬青組和放射+毛冬青組小鼠于放射前給予毛冬青溶液連續灌胃7 d（1 mL/30 mg），其余各組在同等條件下給予等量生理鹽水。采用0.3%戊巴比妥鈉溶液進行腹腔注射麻醉，并將小鼠固定于自制模具中，放置于照射臺上，照射范圍為雙眼后眥連線和雙耳后連線之間。采用60Co γ射線進行照射，放射組和放射+毛冬青組照射劑量10 Gy/次，隔天照射，總劑量為20 Gy。對照組和毛冬青組實驗條件一致，照射劑量為0 Gy。

1.3.2 Morris 水迷宮實驗 造模成功后，每組隨機選取5 只小鼠進行水迷宮實驗，將一圓柱形平臺放置于第Ⅱ象限的中央處，倒入墨水，水溫維持在24～26 ℃，周圍環境保持相對穩定。放射前8 d 開始進行實驗，前3 d 平臺高出水面1 cm，后5 d 平臺沉于水面下1 cm，記錄每只小鼠找到平臺的時間，即為小鼠的逃避潛伏期（EL）。放射后撤去平臺，記錄小鼠的平均速度、第1次穿越平臺的時間、穿越平臺的次數、中環停留時間、外環停留時間以及中心區域的停留時間。

1.3.3 曠場試驗 各組隨機選取5只小鼠于放射前3 d 和放射后，放進100 cm×100 cm×100 cm 的無蓋黑色方箱中，通過動物運動軌跡記錄系統觀察記錄小鼠5 min 內的平均速度、目標區域的運動距離以及第1次進入目標區域的時間。

1.3.4 避暗實驗 避暗箱分為前半部明室和后半部暗室兩部分，兩室之間以直徑為3 cm 的空洞相通。避暗箱底部為銅柵，后半部暗室通以36 V的電壓，實驗開始時將小鼠背對入口放入明室內，記錄小鼠從放入明室到鉆進暗室觸電的時間，即為EL，同時記錄小鼠在3 min 內進入暗室的次數，即為錯誤次數。

1.3.5 ELISA實驗測定血清白細胞介素-6（IL-6）的水平 行為學實驗結束后，采用0.3%戊巴比妥鈉溶液對小鼠進行腹腔注射，眼球取血，4 ℃離心，取上清。將ELISA試劑盒室溫復溫30 min后，根據說明書流程進行操作，酶標儀檢測各組的吸光度（A）值，并計算出各組血清中IL-6的濃度。

1.3.6 HE 染色觀察腦組織病理變化 麻醉后取腦，將腦組織固定于4%多聚甲醛固定液中，24 h 后脫水包埋，將組織切成厚度為4 μm 的切片，按照試劑盒說明書行HE染色，觀察腦組織病理改變。

1.3.7 免疫熒光實驗檢測小鼠腦組織Iba-1 和GFAP 表達水平 石蠟切片經過脫蠟和抗原修復后，分別加入一抗：抗Iba-1（1∶1 500）和抗GFAP（1∶800）抗體4 ℃孵育過夜，經二抗孵育、DAPI 染色后封片，于熒光顯微鏡下觀察。每張切片隨機選取3個視野，并用Image J軟件進行圖像分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0統計軟件和GraphPad Prism 8.0軟件進行數據分析和制圖，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 毛冬青對放射后小鼠Morris 水迷宮實驗結果的影響

放射前，各組小鼠EL未見明顯差異（P＞0.05）；放射后，與對照組比較，放射組平均速度、穿越平臺次數減少，中環停留時間和中心區停留時間均縮短（均P＜0.05）；第1次穿越平臺所用時間和外環的停留時間延長（均P＜0.05）；與放射組比較，放射+毛冬青組平均速度、穿越平臺次數增加，中環停留時間和中心區停留時間增加，第1 次穿越平臺所用時間和外環的停留時間縮短（均P＜0.05），見圖1。

圖1 各組小鼠Morris水迷宮實驗結果比較

2.2 毛冬青對放射后小鼠曠場實驗結果的影響

與對照組比較，放射組小鼠平均速度降低，目標區域的運動距離縮短（均P＜0.05）；第1次進入目標區域的時間延長（P＜0.05）；與放射組比較，放射+毛冬青組小鼠平均速度及在目標區域的運動距離均增加，第1 次進入目標區域的時間縮短（均P＜0.05），見圖2。

圖2 各組小鼠曠場試驗結果比較

2.3 毛冬青對放射后小鼠避暗實驗的影響

與對照組比較，放射組小鼠EL縮短，錯誤次數增加（均P＜0.05）；與放射組比較，放射+毛冬青組小鼠EL 較放射組延長，錯誤次數也減少（均P＜0.05），見圖3。

圖3 各組小鼠避暗實驗比較

2.4 各組小鼠血清IL-6水平比較

與對照組比較，放射組小鼠血清IL-6水平增高（P＜0.05），與放射組相比較，放射+毛冬青組小鼠血清IL-6水平降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 各組小鼠血清IL-6水平比較

2.5 各組小鼠腦組織海馬區組織病理學改變

對照組和毛冬青組海馬區細胞組織結構清晰完整，染色均勻，細胞排列整齊、緊密，細胞周圍間隙較為致密，無明顯水腫；放射組細胞排列分散，間質水腫，胞體縮小、胞質濃縮，出現核固縮現象，經毛冬青干預后，放射+毛冬青組小鼠海馬區組織結構明顯改善，見圖5。

圖5 各組小鼠腦組織海馬區細胞組織病理學變化（HE染色，×400）

2.6 各組小鼠腦組織小膠質細胞Iba-1表達水平比較

與對照組比較，放射組小鼠腦組織中Iba-1表達水平顯著增高（P＜0.05），小膠質細胞呈圓形或橢圓形，排列緊密，細胞體積增大，細胞突起增粗、增長，呈激活狀態；與放射組比較，放射+毛冬青組小鼠腦組織小膠質細胞體積變小，突起變細、變短，排列較為稀疏，Iba-1表達水平降低（P＜0.05），見圖6。

圖6 各組小鼠腦組織中小膠質細胞Iba-1表達水平比較（免疫熒光染色，×200）

2.7 各組小鼠腦組織星形膠質細胞GFAP 表達水平比較

對照組和毛冬青組GFAP 陽性表達較少，胞體小，分布稀疏，突起較細。放射組星形膠質細胞GFAP 表達水平升高（P＜0.05），細胞排列密集、胞體增大，突起變粗；與放射組比較，放射+毛冬青組小鼠腦GFAP表達水平降低（P＜0.05），細胞排列較稀疏、胞體變小，突起較細，見圖7。

圖7 各組小鼠腦組織中星形膠質細胞GFAP表達水平比較（免疫熒光染色，×200）

3 討論

放射性腦損傷是放射治療頭頸部腫瘤后最為嚴重的并發癥，以神經系統的功能損害為主，可出現海馬相關的學習和記憶功能障礙[11]。本研究通過Morris水迷宮實驗發現，放射后，小鼠在水迷宮中游泳的平均速度、穿越平臺次數、中環停留時間及外環停留時間減少，第1 次穿越平臺和外環停留時間明顯增加，與文獻[12-13]報道一致。而經毛冬青干預后，小鼠記憶功能明顯好轉，這提示毛冬青對于放射性腦損傷小鼠的認知功能具有保護作用。

曠場實驗主要用于檢測小鼠自發性活動和探索行為，是評價實驗動物在新環境中自主行為、探索行為和緊張度的方法[14]。小鼠曠場行為實驗結果顯示，放射組小鼠平均速度降低，目標區域的運動距離縮短，第1 次進入目標區域的時間有所延長。而放射+毛冬青小鼠的平均速度及在目標區域的運動距離均有所增加，第1 次進入目標區域的時間縮短。這表明放射后動物多處于多動與焦慮狀態，相對于放射組小鼠，毛冬青干預后焦慮狀態得到改善。避暗實驗操作簡單，且便于觀察，被廣泛地用于動物學習和記憶能力的測試[15]。本實驗中放射后小鼠的EL明顯縮短，錯誤次數明顯增加；與放射組相比，毛冬青干預后小鼠的EL有所延長，錯誤次數也有所減少，并且接近對照組水平。進一步表明毛冬青對放射誘導的腦損傷小鼠的認知功能具有保護作用。因此，從行為學實驗結果中可以推測，放射能引起小鼠學習記憶功能障礙，經毛冬青治療后小鼠的空間學習、記憶能力得到改善，表明毛冬青可以有效改善放射性腦損傷小鼠的記憶認知功能障礙。

海馬是與認知功能密切相關的腦區，具有獲取、形成、維持記憶等多種功能，其中包含多種模式識別受體，容易受到炎癥介質的影響，造成神經元、神經膠質細胞損傷，導致機體認知功能障礙[16]。膠質細胞的功能復雜且多樣化，除了作為填充物質存在于各個神經元之間，還參與調控神經前體細胞增殖分化、軸突延伸與重塑及記憶睡眠等生理行為[17]。有研究顯示，神經膠質細胞對維持腦內穩態、調節神經元功能和維持大腦認知過程起到關鍵作用[18-19]。小膠質細胞是中樞神經系統中最重要的免疫細胞，可以誘導星形膠質細胞活化，并調控其功能活動，且海馬是小鼠大腦中小膠質細胞密度最高的結構之一[20]。大量研究證實，小膠質細胞活化釋放的大量炎性介質，如IL-1β、IL-6等，是神經元損傷的關鍵因子，可導致認知功能障礙[21-22]；同時，星形膠質細胞定位的連接蛋白與記憶的形成和惡化密切相關，生理情況下參與了記憶的形成，而病理情況下星形膠質細胞的激活可能導致神經元損傷和認知能力下降，且對海馬神經的發生起調控作用[23-24]。而Iba-1和GFAP作為兩種神經膠質細胞的特異性標志蛋白，其表達水平反映了神經膠質的功能活化狀態，對認知功能的影響也尤為重要。據文獻報道，射線在治療頭頸部腫瘤患者時，也可能造成神經膠質細胞不同程度的損傷[25]。本研究通過HE 染色發現，放射后海馬區組織結構發生了病理學改變，而毛冬青治療后得到緩解；而免疫熒光實驗發現，放射后小鼠腦組織中Iba-1和GFAP陽性表達水平顯著增高，小膠質細胞體積增大，細胞突起增粗、增長；星形膠質細胞排列密集、胞體增大，突起變粗。毛冬青干預后，小膠質細胞與星形膠質細胞的活化被抑制，Iba-1 和GFAP 陽性表達水平降低，這提示放射改變了Iba-1 和GFAP 的表達水平，影響了小膠質細胞和星形膠質細胞的功能狀態，造成了機體認知能力的下降，而毛冬青可能通過保護小鼠海馬區細胞組織結構，調節放射性腦損傷小鼠神經膠質細胞的狀態，從而改善小鼠的認知功能障礙。

綜上所述，毛冬青對放射性腦損傷認知功能具有保護作用，其機制可能與抑制神經膠質細胞活化有關。毛冬青作為一種常見的天然中草藥，來源廣泛，價格低廉，本研究為臨床上治療放射性腦損傷提供了新的思路。后續將對其潛在的分子機制以及途徑進行更深入的研究。