厭氧條件下群體感應系統對銅綠假單胞菌表型的影響*

唐秀家，葉柳镅，張文淑，李金壟，王 可

（廣西醫科大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，南寧 530021）

銅綠假單胞菌（P.a）是一種常見的條件致病菌，當人體組織屏障遭受破壞或免疫力低下時可引起感染等嚴重疾病[1]。其致病性主要歸因于生物被膜形成以及細胞外毒力因子的產生，例如彈性蛋白酶、綠膿菌素、鼠李糖脂等[2]，而這些均受群體感應系統（QS）所調控[3]。P.a的QS系統分為LasR-LasI、RhlR-RhlI、假單胞菌喹諾酮信號（PQS）[4]。LasRLasI 系統主要是促進毒力基因的表達[5]，RhlR-RhlI系統主要是促進蛋白酶的合成以及綠膿菌素等毒素的分泌[6]，而PQS 系統除了調節生物被膜形成及毒力因子的產生外，還可以通過鐵螯合調控反硝化作用[7]。反硝化是指在缺氧條件下，P.a利用氮氧化物通過異源硝酸鹽呼吸生長的過程[8]。因此，QS在P.a厭氧生長過程中發揮著重要作用。已有報道，P.a以厭氧生長的方式存活于肺囊性纖維化（CF）患者的肺部氣道內[9]。而在CF患者肺中的黏液中，P.a根據氧濃度的不同而變換不同的生長形態以適應環境[10]。由此可見，氧環境的不同也會影響P.a的生長以及致病性。

膿胸是臨床常見疾病。有研究報道，假單胞菌屬是膿胸常見的致病菌之一[11]。而P.a在膿胸患者胸腔積液中的生長特征是否與CF 患者相似，目前尚無文獻報道。因此，本研究主要探討P.a在體外有氧和厭氧條件下的生長、生物被膜形成及毒力因子產生的變化，為以后開展膿胸胸膜腔內P.a的生長特征研究奠定基礎；并利用兩種QS 基因缺陷型菌株PAO1 lasIrhlI和PAO1 lasRrhlR研究QS系統對有氧、厭氧環境下P.a生長、生物被膜形成及毒力因子產生的調節作用。

1 材料與方法

1.1 菌株

PAO1 菌株、PAO1 lasIrhlI 和PAO1 lasRrhlR 基因缺陷型菌株，由新加坡南洋理工大學生命科學院惠贈。

1.2 主要試劑

LB瓊脂粉、LB肉湯、胰蛋白大豆肉湯（TSB）均購自北京陸橋技術股份有限公司；蛋白胨購自北京鴻潤寶順科技有限公司；Tris試劑、PBS均購自北京索萊寶科技有限公司；偶氮酪蛋白、氯化鈉、結晶紫均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；地衣酚購自北京酷爾化學科技有限公司；濃硫酸購自成都市科隆化學品有限公司；彈性蛋白—剛果紅購自上海北諾生物科技有限公司；綠膿菌素測定用培養基購自廣東環凱微生物科技有限公司；無水葡萄糖購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.3 P.a菌液濃度調整

將P.a復蘇后，挑取單個菌落接種于培養基中，37 ℃搖床培養過夜。將菌懸液離心后去上清液，重懸3 次后使用紫外分光光度計測定600 nm 處的吸光度（OD）值為0.1，此菌液濃度約為108CFU/mL。

1.4 實驗分組

實驗設立PAO1 組、PAO1 lasIrhlI 組、PAO1 las-RrhlR組和對照組（無菌株）。分別在有氧和厭氧條件下比較P.a的生長、生物被膜形成和毒力因子產生能力。

1.5 生長曲線的測定

1.5.1 有氧條件下 取上述PAO1、PAO1 lasIrhlI、PAO1 lasRrhlR 菌株108CFU/mL 菌液以0.1 mol/L NaNO3的LB 肉湯培養液（LBN）作為溶劑稀釋至106CFU/mL，接種于24孔板中，無菌同量LBN作為對照組，每隔2 h分別測定570 nm處的OD值（OD570）。

1.5.2 厭氧條件下 將3種菌株按照上述方法稀釋至106CFU/mL，接種于24孔板中，以LBN作為對照組。將24 孔板放置于已放入厭氧反應包的厭氧反應袋中。每隔4 h測定OD570。

1.6 生物被膜形成實驗

按“1.5 項”制備有氧和厭氧所需的P.a菌液，并接種到96孔板中。放入生化培養箱（厭氧組保證厭氧條件），培養24 h后，吸出菌液，用無菌PBS洗滌，自然干燥后加入0.1%結晶紫染液，室溫下染色20 min，去除染色液，用PBS 洗滌后自然干燥，并加入33%冰乙酸溶液，測定OD570。

1.7 厭氧對毒力因子表達的影響

1.7.1 綠膿菌素試驗（熒光法）按“1.3 項”方法調整菌液濃度至108CFU/mL。將菌液以含0.1 mol/L硝酸鈉的PTSB 作為溶劑稀釋至107CFU/mL，將3 種菌株接種到含0.1 mol/L 硝酸鈉的PTSB 的錐形瓶中，將錐形瓶分別置于有氧和厭氧環境中，再置于振蕩器上，37 ℃培養24 h。對照組設置如前所述。24 h后取出錐形瓶，混勻菌液，吸取部分菌液離心10 min，取過濾后上清液加入96 孔板中測定695 nm處的OD值（OD695）。

1.7.2 蛋白水解酶檢測 取“1.7.1 項”制備的24 h菌懸液離心。取部分過濾后上清液加入含等量偶氮酪蛋白混合溶液（5 mg/mL偶氮酪蛋白，0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液），37 ℃孵育1 h后，加入10%三氯乙酸終止反應，靜置，離心，取上清液加入96 孔板中，再加入等量625 mmol/L NaOH，測定420 nm 處的OD值（OD420）。

1.7.3 彈性蛋白酶測定 取“1.7.1 項”制備的24 h菌懸液部分離心10 min。取部分過濾后上清液與適量彈性蛋白—剛果紅緩沖液（5 mg/mL 彈性蛋白—剛果紅，0.1 mol/L Tris-HCl，1 mmol/L CaCl2）混勻，37 ℃孵育16 h后，離心，吸取上清加入96孔板測定490 nm處的OD值（OD490）。

1.7.4 鼠李糖脂測定 取“1.7.1 項”所制備的24 h菌懸液，離心，取過濾后上清液加入等量乙酸乙酯萃取兩次；取有機相并室溫下自然干燥，加入去離子水溶解混勻；取溶解液、0.16%地衣酚和750 μL 60%濃硫酸混勻，水浴加熱30 min，待冷卻至室溫后測定421 nm處的OD值（OD421）。

1.8 統計學方法

采用SPSS 23.0 統計軟件處理數據。根據資料的正態性，如符合正態性采用方差分析，如不符合采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 QS 基因缺陷型菌株和PAO1 菌株在有氧及厭氧環境下的生長曲線

在有氧培養時，PAO1、PAO1 lasIrhlI 基因缺陷型和PAO1 lasRrhlR 基因缺陷型菌株24 h 生長總菌量相近，均在2～3 h 后開始進入對數期，在約12 h左右到達平臺期。3種菌株無明顯差異。在厭氧培養時，PAO1、PAO1 lasIrhlI 基因缺陷型和PAO1 lasRrhlR基因缺陷型菌株生長明顯受限，生長減緩，約在3～4 h后進入對數增長期，12 h到達平臺期，平臺期菌量低于有氧條件，見圖1。

圖1 3種P.a菌株在有氧、厭氧環境下的生長曲線

2.2 PAO1 和QS 基因缺陷型菌株在有氧及厭氧環境下的生物被膜形成能力

在有氧條件下，PAO1 菌株生物被膜形成量高于兩種基因缺陷型菌株（P＜0.05），兩種基因缺陷型菌株生物被膜形成量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；在厭氧條件下，PAO1菌株生物被膜形成量低于有氧條件（P＜0.05），PAO1 菌株生物被膜形成量與兩種基因缺陷型菌株生物被膜形成量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；有氧、厭氧條件下，兩種基因缺陷型菌株生物被膜形成比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 3種P.a菌株在有氧和厭氧環境下的生物被膜形成

2.3 厭氧條件抑制P.a綠膿菌素的產生

在有氧條件下，兩種基因缺陷型菌株僅產生少量綠膿菌素，PAO1 產生的綠膿菌素含量約為基因缺陷型菌株的4倍（P＜0.05）；在厭氧條件下，3種P.a菌株幾乎沒有產生綠膿菌素，與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 3種P.a菌株在有氧和厭氧環境下的綠膿菌素形成

2.4 厭氧條件減少鼠李糖脂含量

在有氧、厭氧條件下，PAO1、PAO1 lasIrhlI 和PAO1 lasRrhlR基因缺陷型菌株均產生鼠李糖脂，鼠李糖脂含量均高于對照組（均P＜0.05）；在有氧、無氧條件下，PAO1 菌株產生的鼠李糖脂含量均高于兩種基因缺陷型菌株（P＜0.05）；在厭氧條件下，PAO1 菌株鼠李糖脂含量低于有氧條件（P＜0.05），見圖4。

圖4 3種P.a菌株在有氧和厭氧環境下的鼠李糖脂形成

2.5 厭氧抑制彈性蛋白酶活性

在有氧條件下，PAO1 彈性蛋白酶活性高于兩種基因缺陷型菌株（P＜0.05）；厭氧條件下，PAO1彈性蛋白酶活性受到明顯抑制，僅為有氧條件下的1/5左右（P＜0.05）；兩種基因缺陷型菌株無論在有氧還是厭氧條件下彈性蛋白酶活性均較低，見圖5。

圖5 3種P.a菌株在有氧、厭氧環境下的彈性蛋白酶形成

2.6 厭氧條件下蛋白水解酶活性減弱

在有氧條件下，PAO1 蛋白水解酶活性高于兩種基因缺陷型菌株蛋白水解酶活性（P＜0.05）；與有氧條件比較，厭氧條件下PAO1 蛋白水解酶活性降低（P＜0.05）；有氧、厭氧條件下，兩種基因缺陷型菌株蛋白水解酶活性比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 3種P.a菌株在有氧和厭氧環境下的蛋白水解酶形成

3 討論

P.a是一種反硝化細菌，具有一套完整的反硝化酶[8]，在厭氧條件下，可以利用N-氧化物作為末端電子受體進行厭氧生長。臨床P.a感染中存在許多厭氧條件，比如慢性CF 患者的氣道、痰液[9]及傷口損傷[12]等，而這些感染都是較難清除的。因此，闡明其在缺氧環境中的生長和致病性，不僅能更好地了解P.a的厭氧代謝及相應的生理特性，也有助于發現新的抗生素靶點及治療方案。

P.a在有氧環境下可產生彈性蛋白酶、蛋白酶、鼠李糖脂、綠膿菌素等多種毒力因子，而這些毒力因子主要是由QS 控制的。研究表明，與有氧條件相比，厭氧條件下，P.a的QS 系統調節能力是減弱的，其致病力也明顯下降[13-14]。為了解P.a在有氧或厭氧條件下表達毒力因子的能力，我們研究了QS雙突變菌株和PAO1分別在有氧或厭氧條件下的彈性蛋白酶和蛋白酶活性以及產生綠膿菌素和鼠李糖脂能力的差異。與之前的報道[14]一致，當PAO1在厭氧條件下生長時，彈性蛋白酶活性明顯受到抑制，僅為有氧條件下的20%左右，僅略高于雙突變菌株在厭氧條件下的彈性蛋白酶活性。此外，與有氧條件相比，蛋白酶活性下降至20%，鼠李糖脂含量下降至1/3，綠膿菌素幾乎不產生。PAO1 lasIrhlI和PAO1 lasRrhlR 基因缺陷型菌株中在有氧條件下僅檢測到微弱的彈性蛋白酶和蛋白酶活性，鼠李糖脂和綠膿菌素僅有少量產生，而厭氧條件下幾乎不表達毒力因子。本研究證實了無論在有氧還是厭氧環境下，QS對PAO1中的這些細胞外毒力因子均有重要的調節作用，但在厭氧環境中調節能力減弱。然而，即使PAO1、QS基因缺陷株產生毒力因子的能力極弱，但其依舊能引起臨床感染[15]。

P.a的慢性感染與生物被膜形成有關。細胞與細胞之間的交流在生物被膜中的組織和分化中起著作用，而QS 系統在細菌細胞間通信中起著尤為重要的作用，這些作用因P.a的不同生活環境而表現不同[16]。本研究中，PAO1的生物被膜形成能力在厭氧條件下明顯下降，僅為有氧條件下的40%左右。PAO1 lasIrhlI 和PAO1 lasRrhlR 雙突變體在有氧和厭氧條件下生物被膜形成能力相近，似乎并沒有受到厭氧環境的影響。在3 次重復實驗中，均觀察到在厭氧條件下PAO1 生物被膜形成量明顯減少，且幾乎與雙突變菌株相同，與以往研究[17]結果相一致，但既往也有研究表明厭氧條件下PAO1 會形成更多生物被膜[18-21]。由于缺乏進一步的實驗和數據，本研究無法準確解釋這一現象。P.a厭氧生物被膜形成的增加，這種不同于有氧條件下的生物被膜形成，其關鍵是細胞的伸長[21]。Hao 等[14]研究了包括PAO1在內的7株臨床分離菌株，發現盡管一些臨床菌株有氧條件下生物被膜形成能力與PAO1 相近，但在厭氧條件下，這些菌株生物被膜形成能力明顯減弱，意味著可能存在著另一種不同于QS 的機制也在調節生物被膜形成的過程。影響生物被膜形成的因素有很多。在厭氧條件下生物被膜的形成涉及多種調控機制，且具有菌株依賴性，不同菌株在相同條件下其所形成生物被膜的能力不一定相同[14]。這些差異可能由實驗參數不同所致，不同的實驗參數也會影響生物被膜的形成[16]。

綜上，P.a在厭氧條件下產生毒力因子的能力減弱，而QS 系統在厭氧條件下也明顯受到抑制。但本研究P.a的生物被膜形成減少，因此，針對這一現象，今后將繼續探究P.a在厭氧條件下致病性機制及其在膿胸胸膜腔內的表型變化。