水稻根系性狀QTL定位及候選基因表達分析

殷文晶， 陳振概， 高佩慧， 蘆 濤， 葉涵斐， 葉潤樂，楊 茜， 路 梅， 王躍星， 饒玉春

(1．浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004；2．中國水稻研究所，浙江 杭州 311121)

0 引 言

水稻(OryzasativaL.)為禾本科稻屬植物，我國主要糧食作物之一[1]．根系是水稻的重要營養器官，在生長發育中發揮著重要的作用，如吸收水肥、固定植株和合成運輸物質等．挖掘并分析水稻根系性狀控制基因，對培育水稻理想株型中根系育種的研究,進而提高水稻糧食產量和品質問題具有重要現實性意義．

凌啟宏等[2]發現，分布深且多縱向的根型可利于葉片直立化生長進而提高水稻產量，提出要著重塑造理想株型中根系這一新要求．袁隆平院士[3]則提出將“根系發達”這一屬性納入構建理想新株型的主要性狀中，并高度重視水稻地下根系與地上部株型相關性的研究[4]．與此同時，魏磊等[5]研究表明，要充分發揮雜交水稻增產的潛力就需要加強根系育種的研究．迄今為止，愈來愈多的根系性狀QTL區間及控制基因被挖掘，較多研究表明，水稻根系性狀屬于多基因控制的數量性狀．

水稻的根系性狀是受多種因素影響的[6]，其相關調控機制復雜．目前，在水稻根系性狀中，挖掘到有關根長的QTLs大約有112個，12條染色體上均有分布．吳偉明[7]通過QTL區間定位檢測發現，在第7，8，9，11和12號染色體上分布著7個與水稻總根長相關的QTLs；在第9，11和12號染色體上分布著6個與根表面積相關的QTLs；另外在第6，9，11和12號染色體上分布著5個與根平均直徑相關的QTLs．根表面積是水稻根系與外界直接接觸的部位，主要發揮從土壤中吸收植物生長所需養分和水分等重要功能．翟榮榮等[8]通過20%PEG溶液模擬干旱條件下的水稻根系發育情況，研究發現，在正常條件下，分別于第2，3號染色體上定位到2個與根表面積相關的QTL；在20%PEG干旱脅迫下，分別于第3，6號染色體上定位到2個與根表面積相關的QTL．研究表明，水稻根系直徑中的篩管與導管越多、越大，很可能會提高根系中水、無機鹽及有機物等營養物質的運輸效率．翟榮榮等[8]利用PEG模擬干旱脅迫環境．在正常條件下，在第11號染色體的RM167～RM5704標記區間內定位到一個與根平均直徑相關的QTL，LOD值為3.62；在干旱脅迫下，在第5號染色體的RM3800～RM3870標記區間內定位到一個與根平均直徑相關的QTL，LOD值為3.38．

以上研究表明，根系性狀的生長情況，對水稻的產量和品質有著直接或間接影響，通過QTL區間定位方法，前人雖已對根系性狀QTL大量挖掘，但已被報道從根系QTLs成功克隆的功能基因并不多．因此，本研究通過利用秈粳交(HZ/Nekken2)構建的重組自交系群體(RILs)為材料，對水稻根系性狀進行QTL定位，挖掘更多與根系性狀相關的基因，以期培育出理想型株型，這對提高水稻產量和品質具有現實性意義．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以秈稻品種華占(HZ)為父本、粳稻品種熱研(Nekken2)為母本，雜交產生F1代，將得到的F1代通過單粒傳法進行套袋自交，經多代連續自交后獲得120個基因型和表型穩定遺傳的重組自交系，組成RILs群體．雙親華占和熱研具有結實率高、稻米品質好、抗病蟲性強等優點．

1.2 實驗方法

1.2.1 水稻種植與管理

從雙親及F12各株系中分別挑選100粒種子，對種子表面消毒處理后進行催芽．首先用70%乙醇浸泡沖洗20～30 min，重復1次；再用30%次氯酸鈉消毒30 s，重復3次；最后用去離子水反復清洗種子10 min．經消毒后的種子浸入水中2 d，隔天換1次水．2 d后用浸濕的紗布包裹種子并放置于37 ℃恒溫培養箱中進行催芽，48 h后挑選長勢基本相同的幼芽放置于96孔水培板裝置中培養．

1.2.2 三葉期根系性狀測定

當幼苗生長至三葉期時，從各株系中選取中間10株無邊際效應的幼苗，使用透視掃描儀(EPSON Expression 12000XL)掃描，測量每個株系的水稻根系并拍照．

利用根系分析軟件WIN.RHIZO.pro.v.2002C對掃描到的根系圖片進行分析，獲得RILs群體三葉期總根長、根表面積、根平均直徑等根系量化數據并利用Excel進行數據處理．

1.2.3 遺傳圖譜構建

將親本HZ和Nekken2雜交產生的子一代以單粒傳法進行連續套袋自交12代后獲得RILs群體．提取并純化第12代親本及120個后代株系DNA后進行基因組測序，整理和分析重組自交系的測序結果，根據均勻分布在12條染色體上的4 858個標記構建遺傳圖譜．

1.2.4 QTL定位

在實驗室前期已完成構建的高密度SNP分子標記連鎖遺傳圖譜基礎上，對已測得根系性狀數據通過復合區間作圖法進行數量性狀(QTL)區間作圖并利用Mapmarker/QTL1.1B對根系性狀進行定位分析，設置閾值LOD為2.0，若在SNP標記中檢測到LOD大于2.0，則認為該處存在QTL．QTL的命名遵循Mccouch等[9]提出的原則．

1.2.5 根系性狀相關基因表達分析

按照總RNA提取試劑盒RNAsimple Total RNA Kit說明書的要求提取Nekken2和HZ兩親本在三葉期時根的總RNA，根據逆轉錄試劑盒的說明要求將RNA反轉成cDNA．根據QTL顯示的結果，在中國水稻基因組注釋數據庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中查閱可能與根系性狀有關的基因，初步篩選候選基因．采用qRT-PCR的方法，分析候選基因在兩親本間的表達差異，相關引物序列見表1．定量結果用2-△△CT方法進行分析[10]．利用Excel和SPSS 21.0等軟件對定量實驗結果進行統計分析，實驗數據間差異采用t檢驗進行比較．

表1 實時熒光定量PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 雙親和RIL群體的表現

對雙親及重組自交系群體的根系性狀：總根長、根表面積、根平均直徑進行分析后發現，在總根長中，Nekken2的總根長為46.38 cm，HZ的為42.79 cm；在根表面積中，Nekken2的根表面積為4.423 cm2，HZ的為4.227 cm2；在根平均直徑中，Nekken2的根平均直徑為0.322 2 mm，HZ的為0.320 2 mm．在以上3個根系性狀中，Nekken2的性狀表型數據均明顯大于HZ的性狀表型．在RILs群體的總根長、根表面積、根平均直徑3個性狀均呈現連續性正態分布，范圍廣泛且存在超親個體(見圖1)，符合QTL作圖要求．

A：總根長；B：根表面積；C：根平均直徑

2.2 根系性狀QTL定位分析

在實驗室前期已構建的分子遺傳連鎖圖譜的基礎上，對重組自交系群體三葉期時的根系性狀進行了QTL檢測分析，符合QTL區間作圖．在本研究中，共檢測到3個與總根長相關的QTL位點，分別位于第2，5，10號染色體上；檢測到3個與根表面積相關的QTL位點，分別位于第2，4，5號染色體上；檢測到6個與根平均直徑相關的QTL位點，分別位于第4，5，9，10和11號染色體上(見表2和圖2)．在總根長性狀中，LOD值最大的QTL位于第5號染色體，遺傳距離為100.72～101.63 cM，LOD值為4.19；根表面積中，LOD值最大的QTL位于第5號染色體，遺傳距離為100.72～101.63 cM，LOD值為3.32；根平均直徑中，LOD值最大的QTL位于第11號染色體，遺傳距離為12.90～13.84 cM，LOD值為3.38．在以上檢測到的根系性狀QTL區間中，總根長和根表面積在第5號染色體上有重復區間，遺傳距離為100.72～101.63 cM；根表面積和根平均直徑在第4號染色體上有重復區間，遺傳距離為132.54～132.79 cM．

表2 根系性狀總根長、根表面積、根平均直徑的QTL分析

圖2 重組自交系根系性狀總根長、根表面積、根平均直徑的QTL位置分布

2.3 根系性狀候選基因分析

根據上述根系性狀QTL定位區間分布，篩選并分析與根發育相關的19個候選基因(見表3)，通過qRT-PCR表達分析發現，在總根長性狀候選基因中的LOC_Os02g06400，LOC_Os02g06490，LOC_Os05g40180，在根表面積候選基因中的LOC_Os02g04590，LOC_Os11g24240，在根平均直徑候選基因中的LOC_Os04g52030，LOC_Os09g29960，LOC_Os09g30120，LOC_Os09g31478在雙親HZ和Nekken2中的表達量均存在差異．在總根長中，LOC_Os02g06400，LOC_Os05g40180在Nekken2中的表達量極顯著高于HZ中的表達量，LOC_Os02g06490的表達量則是極顯著降低，而且以上3個基因位于效應超過3以上的區間內，最大效應值為4.19；在根表面積中，LOC_Os02g04590，LOC_Os11g24240在Nekken2中的表達量顯著高于在HZ中的表達量；在根平均直徑中，LOC_Os04g52030，LOC_Os09g30120，LOC_Os09g31478在Nekken2中的表達量均極顯著高于HZ中的表達量，而LOC_Os09g29960的表達量則極顯著下降(見圖3)．

表3 根系性狀總根長、根表面積、根平均直徑候選基因及功能注釋

3 討 論

水稻的根系是維持水稻在整個生長周期中最重要的“隱藏器官”，對于根系的研究并未得到足夠多的重視．因此，本研究利用重組自交系群體，對根系性狀進行QTL區間定位并進行候選基因分析，通過挖掘根系性狀基因改變地下部分的性狀來培育新型理想植株，這對水稻的產量和品質具有現實性意義．研究結果顯示，共檢測到3個總根長、3個根表面積、6個根平均直徑的QTL，分別位于2，4，5，9，10,11號染色體．

已有研究表明，水稻根系性狀的調控受多種基因的控制．在已檢測到的QTL區間內，通過熒光定量分析得到的總根長、根表面積、根平均直徑在雙親中表達差異較明顯的基因，結合水稻基因組注釋網站(http://rice.plantbiology.msu.edu)和相關文獻進行分析．在總根長中，LOC_Os02g06400編碼1種與生長調節劑相關的蛋白，該蛋白通過外源調控，改善水稻根生育后期的活性，進而增強根的水分和養分的吸收，提高水稻的產量[11]；LOC_Os02g06490編碼與液泡蛋白分選的相關蛋白，通過PIN2調節生長素的極性運輸，參與植物的脅迫響應和形態生成，SNXI和重要信號分子磷脂酸(PA)結合共同調控PIN2液泡降解，進而影響根毛發育[12]；LOC_Os05g40180編碼絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶stt7(葉綠體前體)，該前體通過調控細胞周期蛋白進而影響水稻籽粒的大小和產量，該表達量的上升可能會導致籽粒變長[13]．在根表面積中，LOC_Os02g04590是與生長素獨立生長促進劑相關的基因，在最適濃度下，生長促進劑具

A：總根長；B：根表面積；C：根平均直徑

有提高株高、莖稈粗細、根干質量等作用，進而提高株系數[14]；LOC_Os11g24240編碼芥子酰葡萄糖膽堿芥子酰轉移酶，該酶優先在水稻及玉米的絨氈層中表達，在絨氈層退化和花粉外壁形成中發揮重要作用[15]．有研究發現，該酶產生后優先在絨氈層中積累并參與植物體內C16/C18-ω-羥基脂肪酸氧化途徑的調控，共同控制水稻花藥表皮及外壁的發育[16]；LOC_Os04g52030編碼LSD1亞類家族蛋白，該類家族蛋白是一類特殊的C2C2型鋅指蛋白，在植物中編碼特有的轉錄因子，介導調控細胞程序性死亡，在水稻的葉、莖和根中表達[17]；LOC_Os09g29960是一類含蛋白質的DOF鋅指結構域的水稻DOF轉錄因子家族，在張立成等[18]的研究中發現，DOF轉錄因子調控水稻的抽穗期和分蘗數，進而影響水稻的產量，通過實時定量PCR發現，OsDof6在水稻根、莖、葉中均有不同程度的表達；LOC_Os09g30120編碼csle1-纖維素合成酶樣家族e，該纖維素合成酶受多種生長素調節，共同促進細胞壁的合成與生長[19]；LOC_Os09g31478編碼生長素外排載體成分，有相關研究表明，生長素運輸受到阻礙后，根的側根及再生受到抑制，其根毛的形成和生長也有所降低[20]．

本研究結果表明，在第5號染色體檢測到1個與總根長性狀相關的QTL，閾值達4.19，位于RM3476～RM5970之間，這與前人挖掘到的QTL區間不重疊，且二者物理距離差距較大，推測本研究定位到的QTL可能是一個全新的位點．在第10號染色體上檢測到與總根長性狀相關的位點，與索藝寧等[21]的定位位于相同的染色體區域內，而且遺傳圖距臨近，表明該區段很有可能存在控制水稻總根長性狀的基因，具有較大深入研究的價值，同時為進一步挖掘控制總根長基因提供了參考價值．根平均直徑的QTL定位中，在第5號染色體上定位到2個控制根直徑QTL，位于C568～S14158和S2649～C2067標記區間內，這與曲志恒[22]定位到2個相關QTL中第5號染色體的區域重疊．由此可知，該區間可能存在1個控制水稻根平均直徑的主效QTL．而本研究中，其余檢測到的控制根平均直徑的QTL與前人的研究區間不重疊，且物理距離差距較大，猜測可能是未被發現的QTL．如表2所示，在4號染色體132.54～132.79 cM上挖掘到的有關根表面積和根平均直徑的QTL區間重合，說明這個QTL區間內可能存在同時控制根表面積和根平均直徑的多效基因．

本研究得到了較多的新位點．在第5號染色體上定位到一個閾值達4.19的有關總根長的QTL．有2個閾值較大的QTL位點位于第5和11號染色體上，分別位于100.72～101.63 cM和12.90～13.84 cM區間，閾值分別為3.32和3.38．說明以上區間內很可能存在控制水稻根系性狀的主效基因．可利用這段QTL進行水稻根系性狀控制基因的挖掘，有望應用于理想株型的培育和改良．另外，研究發現在第2，4和5號染色體檢測到的QTL位點不僅閾值較大，且總根長、根表面積和根平均直徑的QTL區間重疊部分較多，表明這些區間內很可能存在同時控制水稻根系多種性狀的多效基因．

研究利用HZ/Nekken2構建的重組自交系群體得到的3個總根長、3個根表面積、6個根平均直徑的QTL，為培育水稻理想株型提供一定的理論基礎．但QTL會受材料及群體的影響，因此，需開展更多關于根系性狀QTL的研究，深入挖掘水稻根系性狀QTL位點，尋找控制根系性狀的主效基因，從地下部分的改變來培育新型理想植株，進而對提高水稻的產量和品質具有現實性意義．