HCD遺傳缺陷基因對奶牛血液脂代謝指標的影響

李坤，趙孝鳳，司敬方，代冬梅，王銘正，俞英，李凱揚，唐韶青，趙康，許維，柳詠雪，肖煒，張毅

（1.中國農業大學動物科技學院，北京 100193；2.北京市畜牧總站，北京 100107；3.天津嘉立荷牧業集團有限公司，天津 300404）

近幾十年奶牛育種成效卓著，基因組選擇技術加快了對優良基因的持續選擇，使奶牛遺傳性能穩步提升。但與此同時，奶牛近交程度也持續增加，遺傳缺陷問題逐漸凸顯[1]。遺傳缺陷基因通過影響奶牛生長發育、降低繁殖效率、增加獸醫成本等形式，給奶牛行業造成可觀的經濟損失[2]。

2015年，德國科學家在荷斯坦牛中發現一種與膽固醇缺乏相關的有害基因HCD (Holstein haplotype for cholesterol deficiency)，該遺傳缺陷的患病犢牛表現為慢性腹瀉和生長遲緩，藥物治療無效，同時患有繼發性肺炎、水腫和低膽固醇血癥，通常在出生后幾天到數月內死亡[3]。全基因組關聯分析將該遺傳缺陷定位于牛11號染色體長1.01Mb的片段上，并推測可能與載脂蛋白B（Apolipoprotein B，APOB）基因有關[4]。而后，全基因組測序揭示該遺傳缺陷的致病機理是APOB基因內插入一個轉座子（ERV2-1），導致APOB基因編碼的載脂蛋白B被截短，從而造成了膽固醇代謝紊亂[5]。

HCD最初被認為是一種常染色體隱性遺傳疾病，而研究者對不同基因型的犢牛及種公牛進行血液指標分析發現，不僅HCD純合個體血液膽固醇濃度比野生型顯著偏低，HCD攜帶者相較于野生型個體膽固醇濃度也低，甚至有些攜帶者表現了臨床病癥[6,7]。但到目前為止，相關研究所用樣本量較少，HCD呈現的不完全隱性遺傳模式還有待深入研究。國內學者最近研究證明HCD已傳播進入中國荷斯坦牛群中[8,9]，但其對奶牛脂代謝的影響尚未有相關報道。本研究通過對比中國荷斯坦牛群HCD攜帶者和野生型個體之間的脂質代謝相關血液指標，探究HCD攜帶者的血液脂代謝規律，驗證HCD特殊的不完全隱性遺傳模式，同時為我國荷斯坦牛群HCD缺陷基因的管控提出建議。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

根據對北京市兩家牛場（以下簡稱牛場A和牛場B）牛只的遺傳缺陷基因型的篩查結果[9]，共挑選62頭奶牛作為對照試驗的樣本，其中牛場A中HCD攜帶者和野生型各13頭，牛場B中HCD攜帶者和野生型各18頭。攜帶者與野生型個體之間的年齡、泌乳狀態、健康狀態、數量等因素都盡可能控制在相同水平。

1.2 血液指標檢測

采取尾靜脈采血的方式，每頭牛采集5mL血液裝入分離膠促凝采血管，立即顛倒混勻5次，靜置后以3 000r/min離心5～8min（至分離膠將血清分離），用移液槍將上層血清吸入2個凍存管，每個管約1mL，放置于-20℃冰箱保存。血液指標檢測通過全自動生化分析儀或半自動生化分析儀完成，包括葡萄糖（GLU）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）5項生化指標。

1.3 統計分析

采用Shapiro-Wilk法（R軟件shapiro.test函數）進行數據正態性檢驗，發現5項血液指標數據均符合正態分布（P＞0.05）。HCD攜帶者和野生型各項血液指標的差異顯著性檢驗采用配對t檢驗，血液生化指標之間的相關性用皮爾遜相關系數度量。

2 結果

2.1 血液指標間的相關性分析

對所有牛只5項血液生化指標之間的相關性分析顯示（圖1），TC、HDL-C、LDL-C之間的相關系數可達到0.85～0.96，即兩兩之間呈現強正相關關系，但TG和GLU、以及TG、GLU與TC、HDL-C、LDL-C三項指標之間的相關系數在0.6以下，觀察不到強的相關性。

圖1 血液指標相關性分析

2.2 日齡對血液指標的影響

在牛場A樣本中，奶牛血液TG和GLU濃度均隨日齡的增加而降低，而TC、HDL-C和LDL-C三項血液指標與日齡呈正相關關系，且野生型個體的血液TC、HDL-C和LDL-C濃度隨日齡的增加表現出的增長幅度較HCD攜帶者更大。牛場B的數據顯示，日齡對HCD攜帶者和野生型5項血液指標的影響趨勢與牛場A類似，但其影響程度較牛場A?。▓D2）。

圖2 日齡對所測5項血液指標的影響

2.3 HCD攜帶者與野生型血液指標差異分析

檢測結果（表1）顯示，牛場A中13頭HCD攜帶者的TC濃度均值為3.14±1.28mmol/L，顯著低于野生型的4.32±2.07mmol/L（P＜0.05）；同時，其LDL-C濃度（0.18±0.14mmol/L）也較野生型（0.38±0.21mmol/L）更低，且差異達到極顯著水平（P＜0.01）。此外，HCD攜帶者的HDL-C、TG和GLU的平均濃度都比野生型更低，但差異不顯著?？傮w而言，牛場A中HCD攜帶者的五項血液指標相比野生型呈現出不同程度的低水平。

牛場B的H C D攜帶者除了T G濃度（0.39±0.05mmol/L）接近于野生型（0.38±0.04mmol/L）外，其他四項指標也都表現出與牛場A相同的較野生型偏低的趨勢，但差異均不顯著（表1）。

表1 HCD攜帶者與野生型血液生化檢驗結果比較(平均值±標準差)

3 討論

此前在荷斯坦牛中鑒定出的遺傳缺陷基因（例如HH1～HH5，CVM，BS，BLAD）均呈常染色體隱性遺傳模式，遺傳缺陷純合子發病，但攜帶者的生理表現完全正常，故只要在種公牛中淘汰缺陷基因，就能完全避免缺陷基因的不利影響。然而，HCD是一個截然不同的缺陷基因，本研究中HCD攜帶者各項血液指標都比野生型偏低，個別指標達到顯著或極顯著水平。這一現象與此前國外研究結果一致[4,7]，印證了HCD是一個不完全隱性的遺傳缺陷基因，故攜帶者較野生型具有更高的脂代謝異常風險，需要針對其設計更合理的育種及管控方案。

目前認為，HCD的分子機理是APOB基因內發生轉座子（ERV2-1）插入，造成APOB基因被截斷，使其無法轉錄翻譯為正常的載脂蛋白B而造成的[5]。而載脂蛋白B是低密度脂蛋白（LDL）的主要載脂蛋白，負責把膽固醇運往肝外組織；同時，LDL表面的載脂蛋白B能與細胞表面的特異性膜受體結合，介導膽固醇被細胞吸收[10]，因此載脂蛋白B是膽固醇運輸和被細胞吸收的關鍵因素。HCD遺傳缺陷導致無法合成正常功能的載脂蛋白B，阻礙了膽固醇的代謝[11]。本研究中HCD攜帶者母牛的血液指標LDL-C和TC水平都顯著低于野生型（P＜0.01），說明HCD攜帶者的膽固醇代謝能力減弱，但其分子機制還不清楚，可能是由于攜帶者APOB基因僅有一個正常的等位基因，降低了載脂蛋白B的生物合成量，從而影響膽固醇的代謝能力。

本研究還探究了各項血液指標的相關性，發現TC、HDL-C、LDL-C兩兩之間都顯示出較強的相關性。這是由于HDL-C和LDL-C都是由載脂蛋白和膽固醇結合形成的，而HDL-C和LDL-C起著運輸膽固醇的作用[12,13]。此外，本研究發現HCD攜帶者的脂代謝指標在不同月齡都有比野生型偏低的趨勢，鑒于年齡對血液指標的影響，本試驗將其作為挑選配對樣本的重要因素。

本研究中兩個牛場的血液指標差異分析的結果存在差異，在牛場B中的統計結果并不顯著，這可能是由于飼養環境和HCD作用機制等因素造成的。首先，表型是由遺傳和環境效應共同作用的結果，飼養方式、飼料、環境等因素可以改善HCD攜帶者缺陷基因的不利影響。在血液檢測結果中，牛場B的所有血液指標濃度都高于牛場A，這可能是因為牛場B的牛群營養水平較好，縮小了HCD缺陷基因造成的差異。另外，鑒于HCD表現為不完全隱性遺傳模式，雜合子有不完全外顯率[6]，意味著其他脂代謝相關基因可能也影響血液指標變化，導致統計結果并不顯著。

HCD缺陷基因已經擴散到我國的牛群中。2021年，研究人員在1 633頭中國荷斯坦牛群中檢測到HCD攜帶頻率為3.62%，在9種常見的遺傳缺陷中屬于較高的頻率[9,14]。由于HCD攜帶者也可能存在一些脂代謝類疾病，甚至表現出缺陷純合的臨床癥狀，這比一般的遺傳缺陷疾病造成更大的飼養管理上的成本，所以應當采取積極的管理措施，控制其負面影響。但因為某些HCD攜帶者是生產性能優異的個體，將其直接剔除得不償失，反而會造成更大的經濟損失[15]。因此，合理的HCD遺傳缺陷基因管理策略應是盡早對奶牛群進行HCD基因檢測，徹底淘汰HCD攜帶者公牛，逐步淘汰HCD攜帶者母牛。另外，在奶牛飼養中通過精準管理，提高HCD攜帶者的營養水平，降低出現脂代謝異常的風險。

4 結論

通過血液指標分析發現HCD攜帶者相比野生型血液中總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）偏低，且這3個指標具有較強的正相關關系。建議對國內種公牛進行HCD分子檢測，徹底淘汰攜帶者公牛。奶牛場也應對HCD缺陷基因進行風險評估，篩查并逐步淘汰HCD攜帶者母牛，從而有效控制HCD遺傳缺陷基因的負面影響。