Piezo1離子通道介導的流體剪切應力抑制MLO-Y4骨細胞凋亡

劉眾成，何良志，移窮，劉雪寧，張坤，王力夫，耿彬，夏亞一，姜金

蘭州大學第二醫院骨科/甘肅省骨與關節疾病重點實驗室，甘肅蘭州 730000

前言

我國罹患骨質疏松人口數量居于世界首位［1］。骨質疏松作為一種好發于中老年人群的慢性、退行性疾病，具有全身骨量減少、女性多于男性、易發生脆性骨折等特點，該疾病是引起50 歲以上人群脆性骨折的主要危險因素［2］。世界范圍內50 歲以上女性中有1/3、男性中有1/5 以上會出現骨質疏松相關骨折［3］。預估我國將在2050年時每年會出現600 萬例因骨質疏松而產生的脆性骨折并造成250 億美元以上的經濟負擔，這也比我國2010年同期數據增長了2.7 倍［4］。這提示了盡管隨著我國經濟迅猛發展，人口老齡化導致罹患骨質疏松的人口基數正在不斷增長。因此，探究骨質疏松的病因、發病機制，延緩骨質疏松進程便成為了亟待解決的醫療問題。

生理狀態下骨量的維持由骨形成、骨重塑與骨吸收建立動態平衡而實現［5］。作為哺乳動物體內骨骼中含量最豐富的細胞—骨細胞在骨形成、骨重塑以及骨量維持發揮著重要作用［6］。骨細胞是骨組織中最主要的機械感受細胞，其通過感受機械刺激發揮內分泌功能［7］。同時，小鼠MLO-Y4細胞系是作為體外實驗研究骨細胞應用最廣的細胞系［6］。自1892年提出Wolff定律以來，機械應力對骨組織的影響逐漸被研究者所重視［8］。Wolff定律提示：骨骼可以接受機械應力的信號并受其影響，機械載荷可以刺激骨形成。目前認為適量力學刺激有利于維持骨量與骨組織的生理功能。Piezo1/2通道（或稱：Fm38A/B）由Coste及其同事在2010年發現［9］。Piezo通道蛋白在骨骼疾病中的研究于2017年開始，Sugimoto等［10］發現Piezo1在靜水壓下通過調節骨形態生發蛋白2表達決定間充質干細胞的命運。然而，機械應力刺激下Piezo1是否對骨細胞表型具有影響目前尚缺乏相關研究。

凋亡又稱細胞生理性、程序性死亡［11］。凋亡是細胞內穩態的關鍵自發性過程，對細胞的健康狀態起著重要作用［12］。Tan 等［13］認為凋亡的Ocy 吸引微環境中的Oc，進而對骨重建產生影響，并發現機械應力抑制腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）誘導的Ocy 凋亡。Yan 等［14］通過流式細胞凋亡檢測發現機械應力可以有效抑制MLO-Y4 細胞凋亡。因此，機械應力對預防或減緩骨細胞凋亡甚至是骨質疏松具有重要作用。然而，具體哪些分子以及調控機制參與其中仍存在一定的不確定性。流體剪切應力（Fluid Shear Stress,FSS）作為體外模擬生物體內應用的最佳機械應力，被廣泛應用于體外細胞實驗。因此，本研究將對Piezo1機械敏感性鈣離子通道介導的FSS抑制MLO-Y4骨細胞凋亡進行研究。

1 方法

1.1 實驗試劑

MLO-Y4 骨細胞購于上海富衡生物科技有限公司。試劑：α-MEM 培養基（Hyclone,美國），胎牛血清（Gibco,美國），胰蛋白酶（Gibco,美國），青霉素-鏈霉素溶液100X、磷酸鹽緩沖液（PBS）、4%多聚甲醛、Triton-X100（Beyotime,中國），DAPI 染色液（Biosharp,中國），Piezo1 一抗、Bcl-2 一抗、Bax 一抗、β-actin一抗、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、山羊抗兔熒光二抗-488（Proteintech,中國），Hoechst-33258 即用型染色液（Solarbio,中國），Annexin V-PI 凋亡檢測試劑盒（Yeasen,中國）。

1.2 細胞培養

將青霉素-鏈霉素溶液100X抽取1 mL加入至9：1比例的完全培養基（α-MEM：胎牛血清）中，細胞培養瓶中加入4 mL 完全培養基，將細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱內，每日觀察1 次，細胞增長至90%密度進行1：2 傳代。傳代前使用PBS 輕柔清洗殘余培養基兩遍，加入500 μL胰蛋白酶懸浮細胞后加入3.5 mL完全培養基重新置入培養箱。

1.3 細胞干預

按課題組既往操作將細胞置于課題組自行研發的FSS 加載裝置中，調整加載參數，待加載完成后取出玻片進行下一步操作［15］。該FSS 加載裝置由6 通道平行小室構成，通過計算機監控實時加載的FSS大小，由計算機監控系統、儲液系統、加載系統以及脈管系統構成［16-17］。Piezo1激動劑Yoda1溶解于DMSO并配置成100 μmol/L濃度，將其加入需要進行干預的細胞培養瓶并使最終濃度為10 μmol/L，作用2 h。Piezo1阻滯劑GsMTx4溶解于PBS并配置成10 μmol/L濃度，將其加入需要進行干預的細胞培養瓶并使最終濃度為4 μmol/L，作用0.5 h。

1.4 免疫熒光

首先使用4%多聚甲醛進行固定30 min（室溫），PBS 清洗3 遍，接下來將細胞置于1%Triton-X100 中通透30 min（室溫），PBS 清洗3 遍，然后將細胞置于10%山羊封閉血清封閉30 min（37 ℃），PBS 清洗3遍，將細胞置于Piezo1 一抗（1：300）中過夜（4 ℃），PBS 清洗5 遍，然后將細胞置于熒光二抗（-488）中染色1 h（37 ℃），PBS 清洗5 遍，最后將細胞置于DAPI染色液中15 min（37 ℃）并在熒光顯微鏡下觀察細胞。

1.5 Hoechst-33258染色

封閉及之前步驟同免疫熒光，PBS清洗完成后將細胞置于Hoechst-33258 即用型染色液中染色20 min（37 ℃）并在熒光顯微鏡下觀察細胞。

1.6 Western Blot檢測

使用RIPA 細胞裂解液與PMSF 以100：1 比例配置裂解液，向干預完成的細胞中加入1.0 mL 裂解液冰上裂解30 min，12 000 rpm 離心20 min 后棄去沉淀。向剩余裂解液中加入1/3 的4x 蛋白質上樣緩沖液。蛋白在10%SDS-PAGE 膠中120 V 電泳，待電泳完成后350 mA恒流轉印30 min，封閉1 h后將轉印膜置于相應一抗中4 ℃過夜，接下來取出轉印膜并置于相應二抗中作用1 h。拭干轉印膜后滴加ECL 發光液并曝光。

1.7 流式細胞檢測凋亡

使用不含EDTA 的胰蛋白酶懸浮細胞后將其加入流式管中，依照AnnexinV-PI 凋亡檢測試劑盒說明書依次配置試劑，將流式管插入流式細胞儀定量計算細胞凋亡率。

1.8 統計學方法

所有需要進行定量分析的實驗均至少進行3 次獨立實驗。首先使用K-S 檢驗（Stata 15.0 軟件）計算所得數據是否滿足正態分布。所有滿足正態分布的數據用均數±標準差表示，使用雙尾t-檢驗或單因素方差分析（Graphpad 8.0 軟件）計算是否具有統計學意義并繪制統計圖。Image-J（1.52 版本,美國）用于計算免疫熒光強度及Western blot 條帶灰度值。Adobe Illustrator（2019 版本,美國）進行圖像組裝及成圖。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FSS激活并上調Piezo1表達

對FSS調控Piezo1通道蛋白的表達進行探究，分別探究不同FSS力梯度（0、3、6、9、12、15、18 dyne/cm2）以及不同時間梯度（0、15、30、45、60、90、120 min）對MLO-Y4 細胞Piezo1 通道蛋白的調控作用。如圖1所示，在MLO-Y4細胞中使用免疫熒光染色對Piezo1通道蛋白進行染色，當加載條件為FSS 力梯度時，9、12 dyne/cm2與空白組Piezo1 免疫熒光強度具有較明顯差異（圖1a）；當加載條件為FSS時間梯度時，30、45 min 與空白組Piezo1 免疫熒光強度具有較明顯差異（圖1b）。

2.2 激活Piezo1通道蛋白抑制MLO-Y4細胞凋亡

按前文條件對Piezo1 進行激活使用的Yoda1 為干預條件（10 μmol/L,2 h）；使用的GsMTx4為干預條件（4 μmol/L,0.5 h），分別與空白組進行比較，觀察Cleaved Caspase-3、Bcl-2 以及Bax 分子的相對表 達量。如圖2所示，使用Yoda1 對MLO-Y4 細胞進行干預時，Cleaved Caspase-3 以及Bax 的蛋白表達量相較于空白組顯著下調（P＜0.000 1,P=0.014 8），Bcl-2的蛋白表達量相較于空白組顯著上調（P=0.046 1）；相對應地，當使用GsMTx4 進行干預時，Cleaved Caspase-3、Bax的蛋白表達量相較于空白組顯著上調（P=0.006 5,0.014 7），Bcl-2 的蛋白表達量相較于空白組顯著下調（P=0.035 6）（圖2a～圖2d）。Hoechst-33258 染色顯示空白組凋亡率為9.35%±1.07%，Yoda1 組凋亡率（6.19%±1.03%）顯著下調（P=0.007 3），而GsMTx4組凋亡率（26.02%±2.58%）顯著上調（P=0.042 0）（圖2e～圖2f）。

2.3 Piezo1介導的FSS抑制MLO-Y4細胞凋亡

按前文條件探究Piezo1介導的FSS對MLO-Y4細胞凋亡的影響，設立4個組：空白組、FSS組、GsMTx4組和FSS+GsMTx4 組，分別使用Western Blot、Hoechst-33258以及流式細胞凋亡檢測技術對MLO-Y4的細胞凋亡進行探究。如圖3所示，當加載FSS 對MLO-Y4細胞進行干預后，Cleaved Caspase-3 以及Bax的蛋白表達量相較于空白組顯著下調（P=0.028 1,0.006 5），Bcl-2蛋白表達量相較于空白組顯著上調（P=0.023 5）；當使用GsMTx4 對MLO-Y4 細胞進行干預后，Cleaved Caspase-3 以及Bax 的蛋白表達量相較于空白組顯著上調（P=0.016 4,0.003 7），Bcl-2蛋白的表達量相較于空白組顯著下調（P=0.034 2）；且FSS+GsMTx4組可以有效阻斷GsMTx4對上述3種蛋白調控的影響（P=0.046 5,0.024 5,0.036 0）（圖3a～圖3c，圖3f）。Hoechst-33258 染色顯示空白組凋亡率為6.04%±0.34%，FSS 組凋亡率相較于空白組（2.25%±0.49%）顯著下調（P=0.026 4），而GsMTx4 組凋亡率（11.12%±0.79%）相較于空白組顯著上調（P=0.032 2），且FSS+GsMTx4 組（6.36%±0.40%）可以有效阻斷GsMTx4對MLO-Y4細胞凋亡的調控作用（P=0.048 6）（圖3d,圖3g）。流式細胞凋亡檢測顯示空白組凋亡率為4.20%±0.10%，FSS 組凋亡率（3.21%±0.15%）相較于空白組顯著下調（P=0.027 6），而GsMTx4組凋亡率（11.13%±1.00%）相較于空白組顯著上調（P=0.030 6），且FSS+GsMTx4 組（6.69%±0.58%）可以有效阻斷GsMTx4對MLO-Y4細胞凋亡的調控作用（P=0.012 3）（圖3e,圖3h）。

3 討論

通過本實驗發現FSS 上調MLO-Y4 細胞中Piezo1 通道的蛋白質表達，FSS 通過上調MLO-Y4 細胞中的Piezo1 通道蛋白進而調控MLO-Y4 細胞中的Cleaved Caspase-3、Bcl-2 以及Bax 蛋白質表達量，并最終抑制該細胞的凋亡。本研究為治療骨量減少以及骨質疏松提供潛在的治療靶點。

本實驗首先探究FSS刺激下Piezo1離子通道的表達情況，并通過免疫熒光與Western Blot實驗發現本課題組研發的FSS加載裝置對MLO-Y4細胞的Piezo1表達呈現隨加載時間以及力梯度增加的“先增后減”的單峰平滑曲線，以6～12 dyne/cm2加載15～45 min 條件下Piezo1呈現表達增高，其中以9 dyne/cm2加載30 min為上調MLO-Y4細胞中Piezo1通道蛋白的條件為最佳。Williams等［18］發現FSS加載范圍在6～60 dyne/cm2時，新生大鼠顱骨細胞的鈣應答會隨著剪切應力的增加而增加。Kapur等［19］發現當FSS加載20 dyne/cm2持續1 h后，人成骨細胞的增殖顯著增加。而Bin等［20］發現當加載條件為12 dyne/cm2持續1 h后，鼠源MC3T3-E1系成骨細胞通過細胞外信號調節激酶5信號通路顯著抑制其凋亡。通過分析上述結果，發現用于模擬體內骨骼微環境的FSS強度對于不同分子的最佳刺激條件不盡相同，普遍的FSS加載條件為6～20 dyne/cm2。

其次，本實驗通過探究骨細胞（MLO-Y4細胞系）中對Piezo1 進行FSS 后上調、激活劑Yoda1 以及阻滯劑GsMTx4 等干預后發現Piezo1 上調表達量或阻滯其表達會影響MLO-Y4 細胞凋亡表型。Piezo1 離子通道自2010年被發現以來，已探明其與體內多種周圍微環境存在FSS的細胞相關疾病有關，例如在血管內皮細胞膜富集的Piezo1 參與調控生物體血壓［21］、在紅細胞細胞膜富集的Piezo1 突變導致溶血性貧血［22］以及在成骨細胞中Piezo1 缺乏可以進一步引起骨丟失［23］等。Sun 等［24］發現敲除成骨細胞Piezo1 基因破壞了成骨細胞的成骨過程并嚴重損壞了骨的結構和強度。Li 等［25］首次報道了FSS 決定骨細胞中Piezo1 的基因表達變化，且成骨細胞和骨細胞中Piezo1缺失導致小鼠骨量顯著下降。

本研究通過Western Blot實驗、Hoechst-33258 以及流式細胞檢測細胞凋亡等多方面驗證了Piezo1 介導的FSS可以改善MLO-Y4細胞狀態并抑制其凋亡，并同時發現Piezo1 的特異性阻滯劑GsMTx4 有促進其凋亡的作用，揭示了Piezo1在對抗骨細胞凋亡中的作用。Tan 等［13］認為凋亡的骨細胞吸引微環境中的破骨細胞，進而對骨重建產生影響，并發現FSS 抑制TNF-α 誘導的骨細胞凋亡。Yan 等［14］通過流式細胞凋亡檢測發現FSS可以有效抑制MLO-Y4細胞凋亡。本研究通過對MLO-Y4 細胞加載FSS 對Piezo1 離子通道的最佳上調條件（9 dyne/cm2持續30 min）后發現Piezo1 介導的FSS 抑制MLO-Y4 細胞凋亡，首次揭示了Piezo1為FSS抑制骨細胞凋亡的重要調控分子。

4 結論

Piezo1 機械敏感性離子通道介導的FSS 在9 dyne/cm2條件下抑制MLO-Y4 骨細胞凋亡，且FSS在該條件下可以有效逆轉Piezo1 阻滯劑GsMTx4 在4 μmol/L作用0.5 h下促進MLO-Y4細胞凋亡作用。