板棗多糖初級結構表征及抗氧化活性

李 楠 張香飛 楊春杰

板棗，別名稷山板棗，是一種藥食兼用果品，主要分布于山西省稷山縣，為山西十大名棗之一。板棗果肉厚，肉質致密，甜味濃，汁液較少，多以干制為主，除基本營養物質還含有維生素、糖類、黃酮、多酚、腺苷類、皂甙類等多種植物化學成分[1-3]。

多糖是一類由至少10個單糖縮合而成的高分子物質，具有良好的抗氧化、抗腫瘤、降血糖、免疫調節及促進腸道健康等生物活性[4-5]。研究[6]發現，多糖的生物功能與其單糖組成、分子量、鏈鏈相互作用和糖苷鍵構象等密切相關。目前有關板棗多糖的研究主要集中在測定其多糖含量、優化其提取工藝上，王小媛等[7]以葡萄糖為標準品，通過苯酚—硫酸法測定不同產地紅棗的多糖含量，結果顯示稷山板棗多糖含量為25.53 g/100 g ·DW；楊萍芳等[8]采用酶法提取稷山板棗多糖，得出酶解溫度55 ℃，酶解時間80 min，纖維素酶添加量0.05%時，多糖得率為3.61%。然而，有關板棗多糖的理化性質、單糖組成，光譜學性質，抗氧化活性等研究較少。

研究擬以板棗為原料，采用水提醇沉、脫蛋白、脫色等方法制備板棗多糖，測定其多糖理化參數，利用離子色譜分析其單糖組成，結合紫外和紅外光譜分析多糖的初級結構特征，并測定多糖的抗氧化活性，以期為進一步研究板棗多糖結構與其功能活性的關系及天然抗氧化劑的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

板棗：采摘于山西省運城市稷山縣；

氫氧化鈉、葡萄糖、抗壞血酸、三氯乙酸、無水乙醇、丙酮、考馬斯亮蘭G250：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

30%過氧化氫、硫酸、苯酚、硫酸亞鐵、水楊酸、過硫酸鉀、四硼酸鈉(硼砂)、乙二胺四乙酸(EDTA)、三氯化鐵、碳酸氫鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉：分析純，天津市瑞金特化學品有限公司；

ABTS(2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、3-羥基聯苯、牛血清白蛋白：合肥博美生物科技有限責任公司；

1-萘酚、D-半乳糖醛酸、透析袋(截留分子量：3 500)：索萊寶化學試劑有限公司；

單糖標準品：色譜純，美國Sigma公司。

1.2 主要儀器與設備

傅立葉紅外光譜儀：TENSOR 27型，Bruker公司；

雙光束紫外可見分光光度計：UV-9000S型，上海元析儀器有限公司；

離子色譜：ICS5000型，賽默飛世爾科技公司；

低速臺式離心機：TD6M型，湖南湘立科學儀器有限公司；

冷凍干燥機：SCIENTZ-10N型，寧波新芝生物有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 板棗多糖提取 將板棗去核，60 ℃烘干、粉碎，用石油醚浸泡12 h脫脂，干燥后得脫脂棗粉；然后參照王曉琴等[9]的方法制備板棗粗多糖。配置10 mg/mL的粗多糖溶液，按體積比1∶1加入10%三氯乙酸溶液，振搖30 min 后，冰箱靜置12 h， 4 000 r/min離心15 min，取上清液12 mL，用6 mol/L氨水調節pH至9，然后加入30%的過氧化氫1 mL，45 ℃脫色2 h，直至溶液顏色澄清透明[10]；將脫色后的溶液透析3 d，冷凍干燥得板棗多糖。

1.3.2 多糖理化指標測定

(1) 溶解性：分別稱取0.5 g多糖放入水、無水乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯中，攪拌，觀察多糖的溶解性。

(2) 酯化度：采用化學滴定法[11]。

(3) 顏色反應：碘—碘化鉀反應、三氯化鐵反應和斐林試劑反應參照戴艷[12]的方法；Molish反應參照王曉琴等[9]的方法；茚三酮反應：取1 mg/mL多糖溶液1 mL，加入茚三酮溶液0.5 mL，沸水浴10 min，觀察有無藍紫色化合物生成。

(4) 總糖含量：采用苯酚硫酸法[13]。

(5) 蛋白質含量：采用考馬斯亮藍法[14]。

(6) 糖醛酸含量：分別移取100 μg/mL半乳糖醛酸溶液 0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL于25 mL比色管中，用蒸餾水補加至1.0 mL。冰水浴冷卻后，加入0.012 5 mol/L四硼酸鈉—硫酸溶液5 mL，混勻，沸水浴加熱5 min，冰水浴冷卻后，加入100 μL 0.15%間羥基聯苯溶液，混勻，靜置5 min，測定524 nm處吸光度，繪制標準曲線[14]。

取質量濃度為50 μg/mL的稷山板棗多糖溶液1 mL，按標準曲線制作方法操作，進行3次平行測定，結果取平均值，代入回歸方程求出樣品液中半乳糖醛酸的含量，按式(1)計算樣品中糖醛酸含量。

(1)

式中：

D——樣品中糖醛酸含量，%；

m——樣品中半乳糖醛酸質量，μg；

W——樣品的質量，μg。

1.3.3 紫外和紅外光譜分析 配制1 mg/mL的多糖溶液，以蒸餾水為空白對照，在200～800 nm內進行紫外光譜掃描，觀察多糖溶液在260 nm和280 nm處有無核酸和蛋白質吸收峰。取1 mg多糖與100 mg KBr，研磨均勻，壓片，在4 000～400 cm-1波數范圍內進行紅外光譜掃描[15]。

1.3.4 單糖組成分析 單糖組成測定參照Wang等[6]的方法并做修改，稱量多糖樣品(5±0.05) mg，加入2 mol/L三氟乙酸溶液1 mL，105 ℃加熱6 h；氮氣吹干；加入甲醇清洗，再吹干，重復2次；加入無菌水溶解，轉入色譜瓶中待測。離子色譜參數：Dionex CarboPac PA10(250 mm×4.0 mm，10 μm)液相色譜柱，電化學檢測器；流動相A為0.1 mol/L NaOH，流動相B為0.1 mol/L NaOH、0.2 mol/L CH3COONa溶液，進樣量5 μL，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃；梯度洗脫條件：0 min，95%A；30 min，80%A；30.1～45 min，60% A；45.1～60 min，95% A。

1.3.5 抗氧化活性分析

(1) DPPH自由基(DPPH·)清除能力：分別取質量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的多糖溶液2.0 mL，加入2 mL 0.08 mmol/L的DPPH乙醇溶液，混勻，25 ℃避光反應30 min，測定517 nm處吸光度[16]。VC作陽性對照。按式(2)計算DPPH·清除率。

(2)

式中：

WDPPH·——DPPH·清除率，%；

Ai，517 nm——測定管吸光度；

Aj，517 nm——乙醇代替DPPH溶液的本底吸光度；

A空白，517 nm——蒸餾水代替樣品的空白吸光度。

(2) 羥自由基(·OH)清除能力：參照教小磐等[16]的方法， VC作為陽性對照。

(3) ABTS自由基(ABTS+·)清除能力：ABTS+·工作液的配制方法參照李楠等[17]的方法。分別取0.2 mL 質量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的多糖溶液，加入4 mL 7 mol/L ABTS+·工作液，混勻，常溫避光反應6 min，測定734 nm處吸光度[18]。VC為陽性對照。按式(3)計算ABTS+·清除率。

(3)

式中：

WABTS+·——ABTS+·清除率，%；

Ai，734 nm——測定管吸光度；

Aj，734 nm——蒸餾水代替ABTS+·溶液的本底吸光度；

A空白，734 nm——蒸餾水代替樣品的空白吸光度。

2 結果與分析

2.1 溶解度、酯化度、顏色反應

多糖不溶于有機溶劑，如乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯等，難溶于冷水，易溶于常溫水和熱水?；瘜W滴定法測定其酯化度為64.7%，說明板棗多糖是一種酸性果膠多糖，另外Zhao等[19]測定河北冬棗多糖的酯化度為49%，王曉琴等[9]測定陜西木棗粗多糖的酯化度為38.4%，因此多糖酯化度不僅受到棗果實品種差異的影響，還可能與產地、生長氣候、多糖提取方式等因素有關。碘—碘化鉀反應陰性，Molish反應陽性，說明板棗多糖不屬于淀粉型多糖[20]。三氯化鐵反應、茚三酮反應均為陰性，說明板棗多糖不含酚羥基和氨基酸。斐林試劑反應陰性，溶液為淺藍色無磚紅色沉淀，說明板棗多糖無還原糖存在。

2.2 總糖、蛋白質和糖醛酸含量

經測定，板棗多糖的總糖含量為52.30%，蛋白質含量為0.90%。由圖1可知，半乳糖醛酸在質量濃度0～80 μg/mL 范圍內線性關系較好，多糖中糖醛酸含量較高，為46.22%。綜上，板棗多糖是一種果膠多糖。

2.3 光譜分析

2.3.1 紫外光譜分析 由圖2可知，板棗多糖在260 nm處無吸收峰，說明其不含核酸；在280 nm處有較弱的蛋白質吸收峰，與多糖中蛋白質含量為0.90%的測定結果相符合，說明多糖中幾乎不含蛋白質。

2.4 單糖組成分析

圖4為單糖標準品和多糖樣品的離子色譜圖。根據單糖標準品的保留時間確定板棗多糖中單糖的種類，利用不同濃度單糖標準品的峰面積繪制標準曲線，根據樣品峰面積確定單糖含量。由表1可知，半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖在板棗多糖中含量較高，葡萄糖、鼠李糖、木糖和甘露糖含量次之，還有較低含量的葡萄糖醛酸、巖藻糖和鹽酸氨基葡萄糖，說明板棗多糖是一類組成復雜的雜多糖，與袁月鵬[23]的研究結果一致。板棗多糖中半乳糖醛酸含量較高，為141.96 μg/mg，推測其為果膠多糖，Chang等[24]對臺灣大棗粗多糖的單糖組成進行了分析，結果為粗多糖中半乳糖醛酸含量占比70.8%，二者研究結果一致。有研究[25]表明，糖醛酸含量高的多糖其生物活性會更強，因為糖醛酸殘基可以使多糖化學特性和溶解性發生改變。板棗多糖含有較高的糖醛酸，因此其生物活性可能較高。

圖1 半乳糖醛酸標準曲線Figure 1 Standard curve of galacturonic acid

圖2 板棗多糖紫外光譜圖Figure 2 UV spectra of polysaccharide from Z. jujuba cv. Banzao

圖3 板棗多糖紅外光譜圖Figure 3 FT-IR spectrum of polysaccharide from Z. jujuba cv. Banzao

1. 巖藻糖 2. D-氨基半乳糖鹽酸鹽 3. 鼠李糖 4. 阿拉伯糖 5. 鹽酸氨基葡萄糖 6. 半乳糖 7. 葡萄糖 8. 木糖 9. 甘露糖 10. 果糖 11. 核糖 12. 半乳糖醛酸 13. 古羅糖醛酸 14. 葡萄糖醛酸 15. 甘露糖醛酸圖4 單糖混標和多糖的離子色譜圖Figure 4 Ion chromatograms of standard monosaccharide mixture and the polysaccharide

2.5 抗氧化活性分析

由圖5可知，板棗多糖可以清除DPPH·、·OH和ABTS+·，且成劑量依賴性。當多糖質量濃度相同時，對自由基清除率大小為： DPPH·>·OH> ABTS+·。

當板棗多糖質量濃度為1.0 mg/mL時，對DPPH·的清除率為23.64%，而王曉琴等[9]的研究結果表明，1.0 mg/mL 的木棗多糖對DPPH·的清除率小于20%，原因可能是板棗多糖含有較多的半乳糖醛酸，高含量的半乳糖醛酸有助于提高多糖的抗氧化活性[25]。

當質量濃度為1.0 mg/mL時，板棗多糖對·OH清除率為21.01%，而0.05 mg/mL的 VC對·OH的清除率為18.28%，所以板棗多糖有較強的·OH清除能力，可以通過加大多糖劑量達到與VC對·OH的清除能力。

當多糖質量濃度為1.0 mg/mL時，對ABTS+·的清除率為13.84%，低于0.02 mg/mL的VC對ABTS+·的清除率(20.28%)。因此，板棗多糖對ABTS+·的清除能力相對較弱。板棗多糖對不同自由基的清除能力不同，可能與多糖的單糖組成、結構及分子量大小有關。

表1 板棗多糖中單糖種類及含量Table 1 Types and contents of monosaccharide in from polysaccharide of Z. jujube cv. Banzaoμg/mg

圖5 多糖對自由基的清除能力Figure 5 The free-radical scavenging activity of polysaccharide

圖6 抗壞血酸(VC)對自由基的清除能力Figure 6 The free-radical scavenging activity of VC

3 結論

以稷山板棗為原料，經水提醇沉、脫蛋白、脫色得到板棗多糖，經測定，板棗多糖總糖含量52.30%，糖醛酸含量46.22%，酯化度為64.7%，說明板棗多糖是一種酸性果膠多糖。多糖用三氟乙酸水解后進行離子色譜測定，得知板棗多糖是一類組成復雜的雜多糖，其主要單糖組成為半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖和甘露糖，其中半乳糖醛酸含量最高，為141.96 μg/mg。傅里葉變換紅外光譜顯示，板棗多糖具有多糖的特征吸收峰，是含有α-糖苷鍵的吡喃糖?？寡趸钚越Y果表明，板棗多糖可以清除DPPH自由基、羥自由基和ABTS自由基且呈劑量依賴性。后續將進一步評價板棗多糖的體內抗氧化活性并深入研究其構效關系及抗氧化活性作用機制。