理筋手法通過PI3K-Akt通路干預兔靜力性損傷的機 制 研 究

孫文靜 馬惠昇 穆 靜 宋 斐 楊 楠 魏曉歌

（1.寧夏醫科大學中醫學院，寧夏銀川750001；2.寧夏少數民族醫藥現代化教育部重點實驗室，寧夏銀川750001）

《素問·長刺節論》云：“病在筋，筋攣節痛，不可以行，名曰筋痹”[1]，筋傷常表現為肌肉筋骨等軟組織攣縮、僵硬和疼痛[2]，臨床上此病患者常見頸部疼痛明顯，形成結節及條索狀物，嚴重者出現頭暈、頭痛、惡心等交感神經興奮癥狀。頸部肌肉長時間緊張收縮，局部缺血缺氧，產生微循環障礙，代謝產物堆積，引起炎癥反應及肌肉纖維化改變，日久不愈則形成粘連及條索狀物[3]。理筋手法立足于中醫經絡學說，具有松解肌肉粘連，緩解痙攣，減輕局部炎癥反應，促進血液循環的作用[4]。

損傷的骨骼肌修復主要依賴肌衛星細胞（muscle satellite cells，MSCs）的增殖與分化。骨骼肌損傷后，肌纖維壞死伴有炎癥因子浸潤，處于靜息狀態的肌衛星細胞被激活[5]，此時胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）與成肌分化 抗 原（myogenic differentiation antigen，MyoD）參與調控成肌細胞融合、分化，在肌細胞再生并生長為成熟肌纖維的過程中發揮重要作用[6]。本研究通過觀察運用理筋手法干預兔骨骼肌慢性靜力性損傷后頸后肌組織磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號通路相關蛋白以及IGF-1和MyoD表達的變化，探索理筋手法促進骨骼肌修復的相關機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 選擇6月齡日本大耳白兔38只，體重（2.0±0.6）kg，雌雄各半，實驗動物由陜西君行生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（陜）2017-001，飼養于寧夏醫科大學實驗動物房，常規分籠飼養。室溫為15～20 ℃，濕度為50%～60%，12 h/12 h明暗周期，自由飲食飲水。實驗過程中對動物的處置符合國家實驗動物倫理的相關規定，嚴格遵守寧夏醫科大學實驗動物倫理原則。

1.2 主要試劑 蘇木素-伊紅（HE）染液（珠海貝索生物技術有限公司，批號：BA-4041），二甲苯（國藥集團化學試劑有限公司），無水乙醇（天津市永大化學試劑有限公司），分化液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：C0163M），DBA顯色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZLI-9018），RIPA裂解液（北京索萊寶公司，批號：R0020），ECL發光試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：sc-2048），PVDF膜（Millipore公司，批號：IPVH00010），山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZB2301），山羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZB2305）。

1.3 主要儀器 包埋機（武漢俊杰電子有限公司），病理切片機（上海徠卡儀器有限公司），光學顯微鏡系統（日本尼康公司），組織攤片機（浙江金華科迪儀器設備有限公司），低溫高速離心機（Eppendorf公司），電泳儀（北京六一公司），轉膜儀系統（ATTO公司），酶標儀（芬蘭雷勃Multiskan）、移液器（吉爾森公司）。

2 實驗方法

2.1 分組 兔適應性飼養1周后，根據隨機數字表法選取3只作為空白組，剩余35只制作頸部靜力性損傷模型。造模成功后，隨機選取5只作為模型組，其余30只隨機分為模型對照組15只和手法治療組15只。

2.2 造模 參照劉志華[7]報道的方法，制作改良頸部模型固定架，建立兔頸部靜力性損傷模型。適當調整固定架大小，以不影響兔正常呼吸為度，且四肢活動正常。固定后兔頭頸前屈45°，每天持續5 h，連續60d。課題組在前期研究中已證明，采用該法造模后，兔頸后肌肌纖維排列扭曲，結構紊亂甚至斷裂溶解，證明此法可以造成兔頸后肌發生慢性靜力性肌損傷，但未造成頸椎骨性生理曲度的改變。

2.3 干預方法 課題組前期研究已明確理筋手法最佳刺激量為2 kg。為保證手法力量及頻率的標準化，選2名熟悉理筋手法操作要點的干預者，先在SF-Ⅲ型智能推拿手法參數測定儀上進行手法力量、頻率等動力學參數訓練，待兩人手法的動力學參數穩定并且達到標準后，再于兔頸部實施手法。手法治療組兔均予松筋、撥筋、順筋3種手法。松筋手法是將大拇指和食指指腹著力于頸椎兩側肌肉，自上而下循環拿揉，頻率100次/min，共5min[8]；撥筋手法以大拇指指腹著力于一側頸肩部肌肉，兩側交替反復進行撥動，頻率80次/min，共5min；順筋手法將兩手拇食指指腹著力于枕骨粗隆下，自上而下推捋頸部肌肉，頻率80次/min，共5min。手法治療組兔每日予手法干預1次，每次15min，連續干預30d。模型對照組不予任何治療，造模成功后觀察30d。

2.4 取材 造模結束后，將空白組3只與模型組5只兔禁食12 h后采用耳緣靜脈空氣栓塞法處死；模型對照組分別于觀察10d、20d、30d后，隨機選取5只兔，禁食12 h后處死；手法治療組分別于干 預10d、20d、30d后，隨 機 選取5只 兔，干 預結束后禁食12 h處死。各組兔處死后各取兩塊約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的頸后肌組織放入4%多聚甲醛中固定，48 h后常規脫水、固定、石蠟包埋，以分別進行HE染色及免疫組織化學法（IHC法）檢測；另各取一塊約50mg的頸后肌組織，迅速放入液氮中凍存，以進行蛋白免疫印跡法（Western blot法）檢測。

2.5 觀察指標

2.5.1 一般情況 造模結束后，觀察造模兔飲食水情況、頸部觸覺及行為學變化，并與空白組兔的一般情況進行比較。

2.5.2 組織形態學 將空白組和模型組兔頸后肌組織石蠟包塊制作切片（厚度為5 μm），常規脫蠟、脫水后放入蘇木素染色液，流水沖洗，鹽酸乙醇分化，繼續放入伊紅溶液染色，流水沖洗，梯度脫水后進行透明及中性樹脂封固。分別于100、200倍光鏡下觀察肌纖維排列走向等組織形態學變化。

2.5.3 IHC法檢測頸后肌組織IGF-1與MyoD陽性表達 各組兔頸后肌組織石蠟切片常規脫蠟水化，放入檸檬酸修復液高壓修復，加入3%甲醇雙氧水20min，水洗后用PBS浸泡1min，5%BSA中孵育30min，滴 加 一 抗IGF-1（1∶100）、MyoD（1∶100）4 ℃過夜，PBS緩沖液洗3次，每次5min，DAB顯色后水洗，蘇木素復染后脫水、透明及中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并分析陽性表達的平均光密度值。

2.5.4 Western blot法檢測頸后肌組織IGF-1、MyoD、PI3K、Akt蛋白表達 取50mg組織，研磨分裝于離心管中，加入250 μL的RIPA裂解液勻漿（使用前5min加入蛋白酶抑制劑），4 ℃過夜裂解，提取蛋白。根據蛋白定量結果，加入蛋白樣品及裂解液，輕輕混合后95 ℃變性10min。制備SDS-PAGE凝膠，依次進行蛋白上樣、電泳、轉膜，將轉移膜置于封閉液中，封閉后的膜放入一抗中，4 ℃孵育過夜（β-actin 1∶3000，P-PI3K 1∶800，P-Akt 1∶400，IGF-1 1∶1000，MyoD 1∶500），將反應膜放入平皿中洗膜，放入二抗工作液中孵育90min（山羊抗兔1∶3000、山羊抗鼠1∶3000），顯色曝光，膠片掃描后，用Image J軟件測定條帶灰度值，進行定量分析。

2.6 統計學方法 實驗數據用SPSS 26.0統計軟件進行分析，所有數據經正態性檢驗及方差齊性檢驗后，均符合正態分布且方差齊，結果以（±s）表示，多組間樣本比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 造模兔與空白組兔一般情況比較 兔造模前期與空白組相比，較煩躁，易激惹，不易抓取，造模后期出現精神倦怠、蜷縮少動、飲食飲水減少等表現。觸碰造模兔頸部時，表現為精神緊張、易躲閃，頸部肌肉較僵硬，可觸及條索狀物。

3.2 空白組與模型組兔頸后肌組織形態學比較 如圖1所示，細胞核呈藍色，細胞質呈紅色?？瞻捉M兔頸后肌組織可見肌纖維排列整齊，細胞核呈卵圓形，形態規則，無組織水腫及炎性浸潤；模型組兔頸后肌組織肌纖維扭曲變形，排列紊亂，肌間隙寬窄不一，可見大量炎性物質滲出。結果顯示骨骼肌靜力性損傷形成，提示造模成功。

圖1 空白組與模型組兔頸后肌組織形態學表現（HE染色）

3.3 IHC法觀察各組兔頸后肌組織IGF-1、MyoD表達 如圖2、圖3所示，細胞核染色為藍色，IGF-1、MyoD陽性表達為棕黃色?？瞻捉M細胞核分布均勻，棕黃色范圍較??；模型組棕黃色范圍顯著增加。模型對照組觀察10d時可見肌間隙明顯增寬，見染色不均，說明只出現了部分IGF-1、MyoD陽性表達；手法治療組干預10d時可見肌間隙明顯增寬，大范圍棕黃色分布，此時IGF-1、MyoD陽性表達較高。模型對照組觀察20d時可見局部肌纖維增寬，棕黃色面積較10d前減少，散在分布，著色不均；手法治療組干預20d時可見肌間隙變小，IGF-1棕黃色分布面積較治療10d時減少，MyoD棕黃色呈散在分布。模型對照組觀察30d時染色部分變少，細胞核分布逐漸均勻，但仍有局部聚集；手法治療組干預30d時細胞核分布均勻，棕黃色染色基本消失。

圖2 各組兔頸后肌組織IGF-1陽性表達（IHC法，×200）

圖3 各組兔頸后肌組織MyoD陽性表達（IHC法，×200）

如表1所示，與空白組比較，模型組兔頸后肌組織IGF-1與MyoD表達量均顯著升高（P＜0.05）；與模型對照組同一觀察時點比較，手法治療組干預10d、20d時IGF-1表達量均顯著升高（P＜0.05），干預10d時MyoD表達量顯著升高（P＜0.05）；隨著觀察/干預時間的延長，模型對照組和手法治療組IGF-1和MyoD表達量均逐漸降低，均以觀察/干預10d時表達量最高。

表1 各組兔頸后肌組織IGF-1、MyoD表達比較（±s，IHC法）

表1 各組兔頸后肌組織IGF-1、MyoD表達比較（±s，IHC法）

注： 與空白組比較，*P＜0.05；與手法治療組（10 d）比較，#P＜0.05；與手法治療組（20 d）比較，△P＜0.05。

組別（觀察/干預期）動物數/只 IGF-1 MyoD空白組 3 0.003±0.002 0.002±0.000模型組 5 0.079±0.025* 0.017±0.003*模型對照組（10d） 5 0.075±0.018# 0.019±0.004#模型對照組（20d） 5 0.035±0.011△ 0.011±0.007模型對照組（30d） 5 0.031±0.021 0.006±0.003手法治療組（10d） 5 0.176±0.023 0.084±0.018手法治療組（20d） 5 0.100±0.022# 0.021±0.006#手法治療組（30d） 5 0.038±0.014#△0.005±0.003#△

3.4 Western blot法觀察各組兔頸后肌組織IGF-1、MyoD、P-PI3K、P-Akt蛋白表達 結果見表2、圖4。模型組兔頸后肌組織IGF-1、MyoD、P-PI3K、P-Akt蛋白表達量均顯著高于空白組（P＜0.05）；手法治療組干預10d、20d時IGF-1、MyoD蛋白表達量均顯著高于同時期模型對照組（P＜0.05），手法治療組干預30d時IGF-1、MyoD蛋白表達量顯著低于同時期模型對照組（P＜0.05）；手法治療組干預10d、20d、30d時P-PI3K、P-Akt蛋白表達量均顯著高于同時期模型對照組（P＜0.05）。

圖4 Western blot法檢測各組兔頸后肌組織IGF-1、MyoD、P-PI3K、P-Akt蛋白表達量

表2 各組兔頸后肌組織IGF-1、MyoD、P-PI3K、P-Akt蛋白表達比較（±s，Western blot法）

表2 各組兔頸后肌組織IGF-1、MyoD、P-PI3K、P-Akt蛋白表達比較（±s，Western blot法）

注： 與空白組比較，*P＜0.05；與手法治療組（10 d）比較，#P＜0.05；與手法治療組（20 d）比較，△P＜0.05；與手法治療組（30 d）比較，☆P＜0.05。

組別（觀察/干預期）動物數/只 IGF-1 MyoD P-PI3K P-Akt空白組 3 0.214±0.026 0.391±0.025 0.234±0.026 0.215±0.028模型組 5 0.817±0.042* 1.245±0.052* 0.789±0.067* 0.660±0.028*模型對照組（10d） 5 0.699±0.028# 0.997±0.005# 0.688±0.048# 0.623±0.033#模型對照組（20d） 5 0.603±0.065△ 0.901±0.026△ 0.549±0.036△ 0.488±0.027△模型對照組（30d） 5 0.435±0.017☆ 0.756±0.041☆ 0.472±0.037☆ 0.377±0.042☆手法治療組（10d） 5 0.941±0.068 1.485±0.059 0.912±0.086 0.743±0.066手法治療組（20d） 5 0.822±0.050# 1.163±0.037# 1.002±0.098 0.769±0.050手法治療組（30d） 5 0.354±0.028#△ 0.690±0.025#△ 0.726±0.108#△ 0.578±0.021#△

隨著觀察/干預時間的延長，模型對照組和手法治療組IGF-1和MyoD蛋白表達量均逐漸降低，均以觀察/干預10d時表達量最高。隨著觀察/干預時間的延長，模型對照組P-PI3K、P-Akt蛋白表達量逐漸降低，而手法治療組P-PI3K、P-Akt蛋白表達量呈現先增高后降低的趨勢。

4 討論

《靈樞·刺節真邪》中提道：“一經上實下虛而不通者，此必有橫絡盛加于大經，令之不通，視而瀉之，此所謂解結也?！盵9]此處“橫絡”可理解為經筋走行上出現的局部條索狀的肌索及結節，“解結”則是針對“橫絡”的治療方法，即松解“橫絡”對經脈、關節的卡壓[10]。我們臨床通過松解肌筋、理筋止痛、正骨順筋的方式，治療頸部筋傷疾病，獲得了較好的療效。課題組前期研究發現，理筋手法中常用的松法、撥法、順法三種手法，廣泛應用于臨床且療效顯著[11]，故設計本研究以探討理筋手法治療靜力性損傷的作用機制。

本研究通過建立兔頸部前屈靜力性損傷模型，觀察理筋手法對頸后肌PI3K-Akt信號通路相關因子表達以及IGF-1、MyoD蛋白表達的影響。骨骼肌損傷后，炎性細胞浸潤增多，處于靜息狀態的肌衛星細胞在生長因子和其他信號蛋白的作用下開始活化，遷移到損傷部位進行增殖，分化的肌衛星細胞形成新生肌管，與原有肌纖維融合或形成新的肌纖維，修復受損骨骼肌[12-14]。

IGF-1是一種蛋白多肽，可以促進蛋白質的合成，有效刺激肌衛星細胞的增殖，增加細胞核數量，刺激肌纖維分化成熟[15]。骨骼肌損傷后在肌衛星細胞的不同階段，肌衛星細胞、成肌細胞和肌管都會分泌IGF-1，IGF-1對肌衛星細胞的增殖具有促進作用[16]。骨骼肌損傷后IGF-1合成和分泌增加，在細胞表面結合受體IGF-1R[17]，受體構象發生改變，激活酪氨酸活性和自身磷酸化，作用于胰島素受體 底 物-1（IRS-1）[18]。IRS-1通過其結構域與受體結合后被磷酸化，激活PI3K，從而導致質膜內磷脂的生成，使Akt磷酸化，致mTOR和p70S6激酶（p70S6K）的激活[19]。該通路的激活提高下游基因的轉錄水平，導致蛋白質合成增加，刺激肌衛星細胞增殖，促進肌細胞分化，恢復肌細胞增殖與凋亡的平衡狀態，加速骨骼肌修復[20]。MRFs基因家族的四種轉錄基因相互作用調控，共同促進肌細胞的生成，調控肌肉組織的生長發育[19]。成肌調節因子之一的MyoD主要在活化的肌衛星細胞中表達，使未分化和已分化的細胞轉化為成肌細胞，促進肌細胞融合形成肌管，是肌衛星細胞激活和增殖的標志[21]。細胞轉錄抑制因子抑制素2（PHB2）能抑制MyoD所依賴的基因轉錄，從而降低肌分化，Akt能抑制MyoD與PHB2的結合，這可能是Akt介導MyoD激活和促進肌分化的機制之一[22]。

本研究結果顯示，骨骼肌損傷形成后，局部肌肉中IGF-1和MyoD蛋白表達量較空白組明顯升高（P＜0.05），說明此時肌衛星細胞開始激活。手法治療組各觀察時點兔頸后肌組織P-PI3K、P-Akt表達量均顯著高于同時期模型對照組（P＜0.05），說明理筋手法作用于PI3K-Akt信號通路。手法治療組干預10d時頸后肌組織IGF-1和MyoD蛋白表達量達到最高（P＜0.05），可能肌衛星細胞此時高度增殖。隨后，IGF-1通過級聯反應向PI3K-Akt信號通路傳導刺激信號，所以手法治療組干預10d、20d時頸后肌組織P-PI3K、P-Akt表達量顯著高于干預30d時（P＜0.05），但干預10d、20d兩個時點上述指標比較差異無統計學意義（P＞0.05），說明手法干預10d、20d時，頸后肌組織P-PI3K、P-Akt表達量顯著升高，促進肌蛋白合成。手法治療組干預20d時頸后肌組織IGF-1和MyoD蛋白表達量較干預10d時明顯降低（P＜0.05），且免疫組織化學法檢測可見陽性細胞核已轉至新生細胞核附近表達，說明此時肌衛星細胞由增殖開始進入分化階段，形成新生肌管，融合成肌纖維，促進骨骼肌的修復。手法治療組各觀察時點比較發現，干預30d時頸后肌組織MyoD陽性表達最低，說明此時肌衛星細胞基本分化成熟，重新回到靜息狀態，骨骼肌修復及重塑已基本完成。

綜上，理筋手法可通過調控MyoD的表達量，加快激活肌衛星細胞增殖分化出成肌細胞，同時介導IGF-1激活PI3K-Akt信號通路，促進損傷部位成肌細胞進一步分化融合，向損傷部位遷移，形成新的肌管修復肌組織損傷。骨骼肌損傷與修復的作用機制較為復雜，涉及多個信號通路，且相互之間交叉影響，因此后期還需進一步深入探索理筋手法對Wnt信號通路、FOXO3信號通路等的影響，以及研究肌細胞骨架蛋白相關機制等，為臨床治療提供基礎理論指導。