指紋圖譜結合一測多評法測定金銀花葉的化學成分

寧二娟， 張麗先， 陳 玲， 李智寧， 王 偉， 李 曉

（河南省科學院河南省納普生物技術有限公司，鄭州 450002）

金銀花是忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的花蕾或帶初開的花，和忍冬藤皆為我國傳統中藥. 金銀花葉為金銀花和忍冬藤的副產物，產量遠大于金銀花. 金銀花葉中富含環烯醚萜類、黃酮類、酚酸類等成分［1-3］，具有抗氧化、抑菌消炎、清熱解毒等藥理活性［4-6］.

目前，關于金銀花葉成分含量測定的研究多集中在酚酸類和黃酮類成分［7-8］，對環烯醚萜類成分的研究相對較少. 本研究將指紋圖譜和多指標成分測定方法相結合，建立金銀花葉的高效液相指紋圖譜. 采用一測多評法（Quantitative Analysis of Multi-components by Single Marker，QAMS），選用綠原酸為參照物，并建立其與新綠原酸、斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸、馬錢苷、斷氧化馬錢子苷、鞣花酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、野漆樹苷及異綠原酸C的相對校正因子，從一年12個月份中的金銀花葉中首次發現斷氧化馬錢苷酸，并對金銀花葉中的斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸和斷氧化馬錢子苷含量進行了測定，為金銀花葉的質量控制以及采收期提供數據分析及理論依據.

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相系統（PDA/UV）、Agilent 1290 型液相色譜-6460 型三重串聯四極桿質譜系統（包括DAD）、Shimadzu LC-20AD 高效液相系統（UV）.

1.2 對照品

木犀草苷（批號111720-201810，質量分數93.5%）、異綠原酸C（批號111894-202103，質量分數95.2%）、綠原酸（批號110753-202018，質量分數96.1%）、馬錢苷（批號111640-201707，質量分數99.2%）、鞣花酸（批號111959-201903，質量分數88.8%），購于中國食品藥品檢定研究院；斷氧化馬錢子苷（批號21061505，質量分數98.16%），購于成都格利普生物科技公司；野漆樹苷（批號17061305，質量分數≥98%）、異綠原酸B（批號21012902，質量分數98.68%），購于成都普菲德公司；新綠原酸（批號wkq18030107，質量分數≥98%）、異綠原酸A（批號wkq18090301，質量分數≥98%），購于四川維克奇生物科技有限公司；斷馬錢子酸（批號CFS201802，質量分數≥98%），購于武漢中標科技公司；斷氧化馬錢苷酸（批號PRF21102243，質量分數≥98%），購于成都普瑞法科技公司.

1.3 試劑

乙酸、甲醇、乙醇均為分析純；色譜乙腈，購于賽默飛世爾科技公司.

1.4 樣本

樣本采自河南封丘同一地塊的金銀花葉（一年中每個月采一次，分別標記），于通風處陰干；經河南省科學院趙天增研究員鑒定確為忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的葉子（表1）.

表1 金銀花葉樣本Tab.1 12 batches of leaves of Lonicera japonica from Fengqiu area

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Agilent色譜柱：型號Eclipse XDB-C18（250×4.6 mm，5 μm）.

流動相：乙腈（A）-0.1%乙酸水（B）. 梯度條件：0～20 min，A5%～17%，B95%～83%；20～26 min，A17%，B83%；26～35 min，A17%～21%，B83%～79%；35～40 min，A21%～25%，B79%～75%.

柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長240 nm，進樣體積10 μL.

2.2 混合對照品溶液的制備

稱取新綠原酸、綠原酸、斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸、馬錢苷、斷氧化馬錢子苷、鞣花酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、野漆樹苷及異綠原酸C對照品于同一量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度處，搖勻，即得混合對照品儲備液. 吸取此儲備液適量于另一20 mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，得混合對照品溶液.

2.3 樣品溶液的制備

陰干的金銀花葉研為細粉過3號篩. 取粉末狀金銀花葉0.5 g置三角瓶中，加入50%乙醇溶液50 mL并稱重；超聲30 min，放至室溫，再稱重，用50%乙醇溶液補重，搖勻，經0.45 μm濾膜，即得樣品溶液.

混合對照品溶液和樣品溶液的HPLC圖譜見圖1.

圖1 混合對照品和樣品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance solution and sample solution

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍考察

線性系列溶液：吸取混合對照品儲備液0.1、0.2、0.5、1 mL，分別置于20、20、10、5 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，標記為線性①、②、③、⑤溶液；以“2.2”項下的混合對照品溶液為線性④溶液.

吸取以上線性溶液進樣測定，以峰面積為縱坐標（Y），進樣濃度為橫坐標（X），得回歸方程和相關系數如表2.

表2 金銀花葉中12種成分的線性回歸方程Tab.2 Linear regression equations of 12 components in Lonicera japonica leaves

2.4.2 精密度試驗

取線性④溶液，連續進樣測定6次，結果12種成分對照品的RSD值依次為1.86%、0.74%、0.91%、1.02%、1.25%、1.90%、1.37%、1.77%、1.13%、1.30%、1.46%、1.55%，表明該儀器的精密度良好.

2.4.3 重復性試驗

取金銀花葉（S4），平行制得6份樣品溶液，進樣測定，用外標法分別計算各指標成分的含量. 得12種成分的質量分數依次為0.045%、2.056%、1.770%、0.607%、0.033%、0.650%、0.016%、0.328%、0.355%、1.421%、0.236%、0.080%；RSD 值分別為2.63%、0.61%、0.77%、0.89%、1.95%、1.32%、2.54%、1.70%、1.58%、1.02%、1.83%、1.94%.

2.4.4 穩定性試驗

取金銀花葉（S4）的同一個樣品溶液，分別于0、l、2、4、6、8、12 h 時進樣測定，計算各指標成分峰面積的RSD 值，結果12 種成分的峰面積RSD 值依次為2.51%、0.95%、1.21%、1.36%、1.81%、1.07%、2.87%、1.71%、1.22%、2.06%、1.69%、1.44%，表明樣品溶液在12 h內穩定.

2.4.5 加樣回收率試驗

稱取金銀花葉（S4）樣品6份，每份0.25 g，置于三角瓶中；分別加入各對照品（新綠原酸0.112 mg、綠原酸5.013 mg、斷氧化馬錢苷酸4.216 mg、斷馬錢子酸1.510 mg、馬錢苷0.080 mg、斷氧化馬錢子苷1.615 mg、鞣花酸0.042 mg、木犀草苷0.814 mg、異綠原酸B 0.890 mg、異綠原酸A 3.452 mg 野漆樹苷0.603 mg和異綠原酸C 0.198 mg），按“2.3項”（樣品溶液的制備）的方法制備溶液并進樣測定；計算各加樣對照品中12種成分的回收率，得結果依次為98.81%、99.54%、99.41%、98.92%、97.92%、99.18%、98.02%、99.33%、99.07%、99.18%、97.79%、98.96%；RSD 值分別為3.16%、1.11%、1.52%、2.57%、2.24%、1.60%、2.38%、2.52%、2.09%、1.82%、1.54%、1.93%；表明準確度良好.

2.5 指紋圖譜的研究

分別稱取S1～S12樣品，按“2.3項”（樣品溶液的制備）的方法制備溶液并進樣測定，記錄色譜圖. 將12批樣品的色譜圖全譜導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統”［9］，采用中位數法生成對照譜圖. 選取S4 作為參照圖譜（R），并進行色譜峰自動匹配及相似度分析，生成金銀花葉指紋圖譜的共有模式（圖2）. 最終確定圖譜中有16個共有峰，指認出其中的12個峰，分別為新綠原酸、綠原酸、斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸、馬錢苷、斷氧化馬錢子苷、鞣花酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、野漆樹苷及異綠原酸C，12批金銀花葉色譜圖與對照指紋圖譜相似度分別為0.957、0.976、0.981、0.976、0.957、0.973、0.931、0.955、0.995、0.925、0.963、0.949.

圖2 12批金銀花葉樣品指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of 12 batches of Lonicera japonica leaves

2.6 QAMS法測定12種成分含量

2.6.1 相對校正因子的計算

據線性溶液中各對照品的含量及對應峰面積，以綠原酸為內標（S），分別計算得新綠原酸、斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸、馬錢苷、斷氧化馬錢子苷、鞣花酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、野漆樹苷及異綠原酸C 11種成分的相對校正因子系數. 結果見表3.

表3 金銀花葉中11種成分的相對校正因子系數Tab.3 Relative correction factor coefficients of 11 components in Lonicera japonica leaves

2.6.2 不同儀器時相對校正因子的考察

分別考察3種HPLC系統（Shimadzu LC-20AD、Agilent 1260-UV、Agilent 1260-DAD）的相對校正因子.結果顯示，3種HPLC系統中的新綠原酸、斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸、馬錢苷、斷氧化馬錢子苷、鞣花酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、野漆樹苷及異綠原酸C與內標物綠原酸的相對校正因子RSD分別為4.25%、3.76%、1.60%、2.95%、3.72%、2.26%、3.07%、4.51%、3.18%、3.04%和2.96%，校正因子重現性良好.

2.6.3 不同色譜柱時相對校正因子的考察

用Agilent 1260 型HPLC 系統，分別考察3 種不同色譜柱（Agilent Eclipse XDB-C18、Agilent ZORBAX SB C18、Phenomenex Luna C18）的相對校正因子. 結果顯示，3 種色譜柱的新綠原酸、斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸、馬錢苷、斷氧化馬錢子苷、鞣花酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、野漆樹苷及異綠原酸C與內標物綠原酸的相對校正因子RSD分別為4.10%、3.54%、1.43%、2.17%、3.65%、1.85%、3.25%、4.77%、3.06%、2.94%和2.51%，校正因子重現性良好.

2.7 QAMS法和外標法測定結果的比較

采取QAMS 法和外標法（ESM）對12 批金銀花葉中的12 種成分含量進行測定（表4）. 兩種方法結果經t檢驗無顯著性差異（P＞0.05）.

表4 金銀花葉中12種成分的含量（n=3，RSD＜2%）Tab.4 Contents of 12 components in Lonicera japonica leaves determinated by the methods of QAMS and ESM單位：%

3 討論

本研究對金銀花葉檢測的色譜條件進行了選擇和優化，在前期金銀花葉研究的試驗基礎上［10］，采用乙腈-乙酸溶液為流動相，考察了不同乙酸濃度（0.1%、0.5%、1.0%）下的色譜圖. 結果顯示，在乙腈-0.1%乙酸水溶液梯度洗脫程序下，流動相滿足各色譜峰分離度要求，各峰峰型良好. 采用DAD對樣品溶液全波長掃描，發現斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸、斷氧化馬錢子苷的最大吸收波長分別為234、244、240 nm；木犀草苷的最大吸收波長為348 nm和252 nm；有機酸類成分的最大吸收波長為327 nm，但是在220～240 nm處仍有較好吸收；為兼顧樣品中的所有成分，在同一波長下檢測實現多指標成分的準確定量測定，綜合考慮了目標色譜峰響應值和分離度，最終選擇240 nm 作為檢測波長. 色譜柱考察了Diamonsil Plus C18、Agilent Eclipse XDB-C18、Agilent ZORBAX SB-C18，最后選擇Agilent Eclipse XDB-C18柱，峰型、分離度均較好.

參考2020年《中華人民共和國藥典》金銀花項下金銀花藥材的檢測方法［11］，樣品選擇超聲提取，考察了水和30%、50%、70%、95%乙醇作為提取溶劑，發現用50%乙醇作為提取溶劑時，各成分提取率高.

本研究建立了HPLC法同時測定金銀花葉中新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、鞣花酸、斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸、馬錢苷、斷氧化馬錢子苷、木犀草苷及野漆樹苷12種成分，以綠原酸為參照物，采用一測多評法對其他11種成分同時測定，確定了其相對校正因子，且不同條件下相對校正因子重現性良好，對同一產地12個月采摘的金銀花葉進行測定，發現外標法和QAMS法測定12種成分含量無明顯差異. 12批金銀花葉的指紋圖譜相似度＞0.925，得到16個共有峰.

經本試驗提取、分析并定量測定的金銀花葉12 種成分，經過HPLC-MS 檢測第4 個峰的分子質量為390.0；通過參考文獻［12］和標準品驗證，發現此峰為斷氧化馬錢苷酸，為首次從金銀花葉分離得到. 綠原酸為有機酸類中的主要成分，其在金銀花葉中的含量1—4月呈上升趨勢，5月有所下降，6月達到一年中最高值. 經分析，綠原酸的含量的這種變化可能與不同時期金銀花的生長存在密切聯系：封丘金銀花在5 月開花，綠原酸從葉向花中轉移，從而造成在葉子中含量降低；6月，由于光照時間長，光合作用增強，葉子中又生成大量的綠原酸，故出現這種現象. 斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸和斷氧化馬錢子苷屬環烯醚萜苷類，已有研究表明，環烯醚萜苷類具有良好的抗病毒活性［13-14］，其總量的變化與花中成分的轉移關系不大，推斷其總量主要受植物生長期的影響.

通過表4也可以看出，4—8月金銀花葉中各成分的含量較高，金銀花的剪枝多在每年的5—8月采花后，目的是促進形成多茬花，提高產量［15］. 因此，建議采摘金銀花葉的時間可以在每年的采花后進行，此時不但其葉片中各種有效成分含量高，還可以提高金銀花的產量.