水處理周期中微生物群落結構的變化

章 霞，徐志進，李偉業，殷小龍，馬雪彬，陳 爽

(浙江省舟山市水產研究所，浙江舟山 316000)

水產養殖總產量和集約化程度日益增加，我國養殖產量已占世界養殖產量的 60% 以上[1-2]，隨之而來的尾水處理問題已經成為研究的焦點。在目前的工廠化循環水養殖中，生物濾池是重要的水處理環節。而微生物群落結構是影響生物濾池的水處理效果的重要因素[3]，這使得研究水處理周期中的微生物群落結構變化具有重要意義。

水處理系統中微生物群落結構與養殖環境因子息息相關。陳琛等[4]研究發現養殖密度會顯著影響凡納濱對蝦養殖水體中微生物群落特征。程璐璐等[5]研究發現緩釋碳源生態基質的添加可使系統優勢菌屬生物占比發生變化，假單胞菌(Pseudomonas) 占比增加，脫氮效果得到提高；包鵬等[6]研究發現低溶解氧可以引起較高的生物多樣性，而高溶解氧則更利于硝化功能菌(Proteobacteria菌門的Nitrosomonas菌屬、Nitrospirae菌門的Nitrospira菌屬)的富集。以上研究表明，養殖環境因子不僅會影響養殖對象的生理狀態，也會改變養殖環境中微生物群落結構。

碳源的添加方式是反應器運行效果的影響因素之一。Ciggin等[7]研究表明分次添加碳源的方式比連續添加更加能促進微生物的生長。張萬友等[8]研究表明分次添加碳源的處理方式在處理序批式反應器(sequencing batch reactor,SBR)中更加有利于提高反硝化效率。張蘭河等[9]對碳源投加方式對SBR工藝脫氮速率的影響的研究結果也表明分次添加碳源能夠提高有機物質的反應速率和總氮去除率。而碳源添加后在水處理周期對微生物群落多樣性結構的影響鮮見報道。該研究擬通過對配置黑石斑循環水人工廢水的水處理效果和微生物群落的動態變化進行研究，為今后深入開展微生物菌落調控水處理效果提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料選取聚苯乙烯泡沫濾珠(EPS)作為生物濾料，放置在自行設計的簡易的循環水系統，進行生物掛膜水處理。裝置上部為40 L的濾料桶(直徑25 cm，高81.6 cm)，其中裝有20 L濾料，下部為直徑120 cm、高70 cm的蓄水桶，盛放水體約400 L，通過水泵(流量2 600 L/h)實現下進水、上出水循環，濾料∶水體體積比為1∶20。濾料圖和水處理裝置圖見圖1～2。

圖1 濾料聚苯乙烯泡沫濾珠數碼攝像

圖2 水處理裝置(單位：cm)

1.2 試驗方法

1.2.1水處理試驗。根據前期水處理掛膜試驗條件配置黑石斑循環水人工廢水400 L[10]，使得水體指標初始值氨氮(NH4+-N)約為2.5 mg/L，亞硝酸鹽(NO2--N)約為5 mg/L，磷酸鹽(PO43--P)約為0.5 mg/L，硝酸鹽(NO3--N)約為0.5 mg/L。添加葡萄糖71 g使得水體中總有機碳(TOC)約為80 mg/L(TOC-葡萄糖配制標準曲線y=460.32x-1.922 1，R2=0.999 3)，初始碳氮比設置為TOC∶無機氮≈10∶1，設置3個重復開展水處理試驗，試驗過程中不換水，試驗周期為11 d。

1.2.2水質測定。前6 d每天統一時間取樣測定水體中氨氮和亞硝酸鹽，后4 d，每隔1 d測定水中氨氮和亞硝酸鹽。氨氮測定采用GB 17378.4—2007次溴酸鹽氧化法，亞硝酸鹽測定采用GB 17378.4—2007萘乙二胺分光光度法，采用總有機碳分析儀 TOC-LCPH CN200測定水體中TOC濃度。

1.2.3水體中微生物多樣性檢測。每隔1 d取濾膜測定微生物多樣性。水體微生物取樣：每個桶各取水樣2 L，經0.22 μm 濾膜過濾，每組混合為1個樣本。樣本記錄為D1、D3、D5、D7、D9、D11。

DNA提取并擴增測序分析：采用DNeasy PowerSoil Kit(50)(MoBio)試劑盒提取DNA，并采用引物進行16S rDNA V4高可變區的PCR擴增，具體擴增方法參照文獻[10]，擴增產物送至上海歐易生物醫學科技有限公司進行測序。

1.3 數據分析水質試驗數據采用Excel 2007和SPSS 19.0軟件進行數據分析和差異顯著性檢驗(α=0.05)。測序數據由 Illumina miseq 測序獲得原始雙端測序數據，先需要進行去雜、拼接、嵌合體序列處理，獲得較為優質的序列 valid tags，再進行分類 OTU、系統發育樹、Alpha和Beta 多樣性等分析。

2 結果與分析

2.1 水體中氨氮、亞硝酸鹽、TOC的變化由圖3可知，在水處理過程中，氨氮出現2個波峰，分別在第1天和第3天，在第2天氨氮的去除率可達63.0%，在第4天后氨氮趨于穩定，最終去除率可達98.0%以上；亞硝酸鹽和TOC濃度呈下降趨勢，在第1天時下降速率最快，到第4天有輕微的增長，后續下降后趨于穩定，在第2天亞硝酸鹽去除率可達81.2%，TOC去除率為73.4%，最終去除率分別可達99.0%和95.0%以上。

圖3 水體中氨氮、亞硝酸鹽、TOC濃度變化

2.2 不同時間水體中細菌豐度及多樣性的變化從表1可以看出，在循環水處理周期中，微生物原始序列呈增長再平緩最后下降的趨勢，有效序列在第3天(D3)顯著高于其他各組；操作分類單元數量在第3天最少，為128，第5天(D5)之后為730以上，顯著高于第3天；通過比較3個樣品細菌豐富度情況，從Chao指數可以看出微生物豐富度在第9天(D9)最高，從Shannon指數、Simpson指數發現群落多樣性在第5天最高，最低的為第3天。

表1 不同時間水處理系統中細菌豐度情況

2.3 不同時間水體微生物Alpha多樣性指數分析和物種間相似性的變化從Rank Abundance曲線可以看出樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。曲線在橫軸上的長度越寬表示物種組成越豐富，而在縱軸上跨度越小、曲線越平坦表示物種組成均勻程度越高。圖4表明，D3的微生物物種組成相較于其他各組最為豐富，最為均勻，其次是D1、D9。根據OTU注釋結果，繪制6個樣本的微生物物種間相似性的聚類圖包括樣本間聚類關系樹(圖5)，可以看出自第5天之后，水體中物種相似性越來越高。

圖4 不同時間運行系統中細菌的豐富程度比較

圖5 不同時間循環水中微生物DNA樣本的相似性聚類

2.4 不同時間水體微生物在門、屬分類層面的變化

2.4.1在門分類層面的變化。從表2可以看出，整個周期中，隨著水處理時間的延長，各個時間段的優勢細菌在門分類上變化不大，變形菌門在水體中占主要優勢，擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門不同時間點有所差異。第1天(D1)細菌豐富度排列前5的門類為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門；第3天(D3)細菌豐富度排列前5的門類為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門、TM6；第5天(D5)細菌豐富度排列前5的門類為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、TM6、藍藻菌門；第7天(D7)細菌豐富度排列前5的門類為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、TM6、Gracilibacteria；第9天(D9)細菌豐富度排列前5的門類為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、TM6；第11天(D11)細菌豐富度排列前5的門類為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、Gracilibacteria。在水處理周期內，微生物群落組成占比呈現一定的變化趨勢。水體中的變形菌門在前3 d占比達95.00%以上，第5天之后從77.79%逐漸下降至63.67%；擬桿菌門在第5天時急劇增長，并在后續時間段波動維持；厚壁菌門在第7天后呈現增長態勢，第9天約為第7天的32倍。放線菌門先下降后上升再下降，在第3天占比最低，第7天最高；TM6呈先升高后降低的趨勢，在第5天最高。

表2 不同時間水處理中細菌(門)的群落組成相對百分比

2.4.2在屬分類層面的變化。從表3可以看出，水體中細菌豐富度屬類差異較大。第1天(D1)，細菌豐富度排列前5的屬類依次為遠洋桿菌屬、發光桿菌屬、弧菌屬、Candidatus_Aquiluna、Owenweeksia；第3天(D3)，細菌豐富度排列前5的屬類依次為弧菌屬、遠洋桿菌屬、蛭弧菌屬、Fabibacter、發光桿菌屬；第5天(D5)，細菌豐富度排列前5的屬類依次為遠洋桿菌屬、蛭弧菌屬、弧菌屬、Fabibacter、Candidatus_Aquiluna;第7天(D7)，細菌豐富度排列前5的屬類依次為遠洋桿菌屬、弗朗西斯氏菌屬、弧菌屬、Candidatus_Aquiluna、蛭弧菌屬；第9天(D9)，細菌豐富度排列前5的屬類依次為遠洋桿菌屬、弗朗西斯氏菌屬、擬桿菌屬、糞桿菌屬、Owenweeksia；第11天(D11)，細菌豐富度排列前5的屬類依次為遠洋桿菌屬、擬桿菌屬、糞桿菌屬、Owenweeksia、弗朗西斯氏菌屬。在水處理周期內，微生物群落組成占比呈現一定的變化趨勢。遠洋桿菌素在第1天時占比最高，為69.76%，第3天迅速下降，第5天后逐漸升高，到第11天占比為40.83%，低于第1天；弧菌屬在第1天占比為2.97%，第3天迅速增至98.07%，第5天下降至8.38%，到第11天占比僅為0.47%；蛭弧菌屬在前3 d 呈現低占比,為0.08%～0.16%，第5天呈現一個峰值，占比為18.53%，第7天后逐漸下降；弗朗西斯氏菌屬前9 d呈現增長態勢，第11天下降；擬桿菌屬在第9天有所增長，第11天占比達6.87%。

表3 不同時間水處理中細菌(屬)的群落組成相對百分比

3 討論與結論

變形菌門(Proteobacteria) 通常是水環境中主要的原核生物，包含了光營養型、化能自養型和化能異養型細菌，這類細菌在水環境中普遍存在，相關報道指出在濕地、養殖廢水和深海沉積物等環境中以第一優勢門存在[11-12]。從該試驗結果來看，在整個水處理過程中，變形菌門都保持第一優勢菌門的存在(占比63.67%～99.68%)；而在11 d的水處理中，水體中的擬桿菌門和厚壁菌門呈快速增長，變形菌門占比逐漸下降，由變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門構成了水體中的優勢菌，有研究表明厚壁菌門和擬桿菌門存在一種相互促進的共生關系，且能降解水體中的蛋白質、糖類等物質[13-14]。推測是水體中的糖類促進了厚壁菌門和擬桿菌門的生長，而氮元素比例的減少，是變形菌門相對豐度下降的主要原因[15]。此外水體中藍藻菌門在第5天占比達到峰值，之后則占比逐漸下降，推測藍藻菌門與水體中的氮元素有密切關系，前期可能是因為水體中豐富的氮磷營養鹽為藍細菌的生長繁殖提供了便利[16]，后期是因為水體中碳源、氮源的消耗而造成其相對豐度下降。

眾所周知，弧菌病是海水養殖中最常見、流行廣、危害大的一類疾病[17]。例如，哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)可以感染海洋脊椎動物和無脊椎動物，引發魚蝦感染發病，造成大量死亡[18]。而在此次試驗中，在水處理的第3天，水體中弧菌屬暴發性的增長，細菌(屬)的群落組成相對百分比為98.07%，此時水體中氨氮也達到了第二次峰值，推測水體中弧菌屬細菌的生長與氨氮濃度之間具有密切相關關系；在第5天和第7天，所占百分比分別為8.38%和2.35%，第9天和第11天分別為0.63%和0.47%。蛭弧菌屬在第5天群落占比最高，在7 d后逐漸下降。蛭弧菌是一種短時間內侵染和裂解弧菌、氣單胞菌等革蘭氏陰性致病菌的小型寄生性細菌，同時可有效控制水體中氨氮、亞硝酸鹽、硫化物等有害物質的含量，達到改良水質的目的[19-20]。

綜上所述，由EPS泡沫濾珠作為生物濾料構建的水處理系統具有較好的廢水處理能力，氨氮、亞硝酸鹽、TOC的最終去除率分別可達98.0%、99.0%和95.0%以上。系統處理第5天后，水質情況趨于穩定。而在該試驗條件運行中，發現水體中的微生物豐富度在第9天最高，群落多樣性在第5天最高，整個周期中優勢細菌在門分類上變化不大，變形菌門在水體中占主要優勢，推測其在水處理過程中發揮重要作用。