慢性牙周炎通過PERK-CHOP信號通路介導睪周脂肪細胞凋亡的研究

陳伊燕，伍倩琪，陸佳藝，郭呂華

牙周炎是嚴重危害口腔健康的慢性炎癥性疾病，不僅破壞口腔局部軟硬組織，還對全身健康造成不良影響[1]。研究表明，牙周炎的持續感染可加重肥胖、糖尿病等全身性疾病[2-3]，與內臟脂肪組織的功能受損有關[4-5]。本課題組前期研究發現，牙齦卟啉單胞菌來源的脂多糖(Porphyromonasgingivalis-lipopolysaccharid，P.gingivalis-LPS)可通過內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)促進內臟脂肪細胞的胰島素抵抗[6]。蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)是ERS中重要的信號分子之一，可通過調控下游分子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)，引發多種組織細胞的凋亡[7]，從而對機體代謝產生影響。然而，牙周炎能否通過PERK-CHOP信號通路調控內臟脂肪細胞凋亡，目前尚未見報道。本實驗擬采用P.gingivalis-LPS誘導大鼠慢性牙周炎，觀察以睪周脂肪組織為代表的內臟脂肪組織中PERK-CHOP信號通路的改變，檢測睪周脂肪細胞凋亡的變化，為進一步研究牙周炎對內臟脂肪組織功能的影響提供動物學研究證據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠20只(購于廣東省醫學實驗動物中心)，體質量250～300 g，8周齡，SPF級。根據隨機數字表法均分成實驗組和對照組，每組10只，使用金屬耳標標記。實驗大鼠5只一組，分籠飼養，定期觀察。喂養過程保持動物原有習性，維持其日常生理狀態，每周換水和飼料兩次，適應性喂養1周后進行實驗。本研究經過廣州永諾醫學實驗動物中心動物倫理委員會審核(SYXK(粵)：2018-0186)，符合動物保護、動物福利和倫理原則。

1.2 試劑與儀器

P.gingivalis-LPS(InvivoGen，美國)，一抗PERK(ab229912)、CHOP(ab179823)、Caspase-12(ab62484)、Cleaved-Caspase-3(ab184787)(Abcam，美國)，p-PERK(3179S)(CST，美國)，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(G3250)(Promega，美國)，微量注射器(7633-01)(Hamilton，瑞士)，4-0醫用絲線(強生，中國)，病理組織包埋機(EC1150C型)(徠卡，德國)，光學顯微鏡(BX41TF型)(奧林巴斯，日本)，Micro-CT機(sky1172)(Bruker，德國)。

1.3 建模與分組

實驗組大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉，麻醉后觀察大鼠呼吸情況，并用絲線勾拉舌向外，以免舌體后墜引起窒息死亡。使用尼龍繩牽拉四肢并將大鼠仰面穩定于動物固定板上。利用絲線充分牽拉上下切牙以暴露口腔環境。操作過程中嚴密觀察大鼠的呼吸、心跳情況。用持針器加持4-0絲線，分別從雙側上頜第二磨牙近遠中鄰面壓入牙頸部，絲線兩端打結于腭側牙頸部。使用牙齦分離器將絲線及結節壓入齦溝內。同時用微量注射器注射5 μL 4 g/LP.gingivalis-LPS至齦溝內。

對照組大鼠麻醉后齦溝內注射5 μL PBS。兩組小鼠注射頻率為一周2次，共建模3個月。建模過程每周2次檢查口內絲線情況，若發現脫落，及時重新結扎。

1.4 建模效果評價

本實驗分別于結扎前(基線)及結扎后3個月記錄牙齦出血指數(gingival bleeding index，GBI)和牙周袋探診深度(probing pocket depth，PPD)。GBI測量方法如下：使用尖端半徑為0.2 mm的牙周探針探測雙側上頜第二磨牙齦溝10 s，根據Liu等[8]的分類計分，0=正常牙齦；1=輕微炎癥，探之不出血；2=輕度炎癥，牙齦發紅、無水腫、探之點狀出血；3=中度炎癥，牙齦發紅、輕度水腫、出血滯留齦溝；4=重度炎癥，牙齦發紅、重度水腫、出血溢出齦溝；5=嚴重炎癥，牙齦發紅明顯、嚴重水腫、自發性出血和潰瘍。PPD測定方法如下：使用牙周探針探查雙側上頜第二磨牙近頰、頰側中點及遠頰3個位點齦緣到齦溝底的距離[8]，取平均值記錄。大鼠處死后行上頜骨Micro-CT檢測，測量雙側上頜第二磨牙近遠中釉牙骨質界(cemento-enamel junction，CEJ)至牙槽嵴頂(alveolar bone crest，ABC)的距離(CEJ-ABC)。綜合上述指標，評價牙周炎建模效果。

1.5 TUNEL染色檢測睪周脂肪細胞凋亡水平

大鼠的內臟脂肪細胞主要分布在睪周、腸系膜周圍、腎周三個部位。睪周脂肪組織具有血管分布少、解剖結構清晰及取材方便等特點，在既往研究中常用來代表內臟脂肪組織[9-10]，因此本研究選取睪周脂肪組織作為內臟脂肪組織的代表進行取材。兩組大鼠睪周脂肪組織切片脫蠟脫水，PBS漂洗，加入3% H2O237 ℃孵育40 min，PBS漂洗，加入蛋白酶K孵育10 min，PBS漂洗。按照試劑盒說明書說明，將TUNEL混合物置于切片，37 ℃孵育30 min，漂洗，DAB顯色，蘇木素復染，脫水至透明，封片。圖像分析系統分析病理圖片，在200倍光鏡視野下，隨機選取5個視野，胞核染成綠色標記為凋亡細胞核數，胞核染成藍色標記為細胞核總數。根據尹忠浩等[11]的研究，計算睪周脂肪細胞凋亡百分率=凋亡細胞核數÷細胞核總數×100%。

1.6 Western blot檢測PERK、p-PERK、CHOP、Caspase-12、Cleaved-Caspase-3蛋白表達

兩組大鼠取100 mg睪周脂肪組織提取蛋白，沖洗后破碎，置于干冰上加入裂解液，12 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液，測定蛋白濃度，-80 ℃保存備用。50 μg/孔，電泳，孵育一抗PERK(1∶1 000)、p-PERK(1∶1 000)、CHOP(1∶1 000)、Caspase-12(1∶500)、Cleaved-Caspase-3(1∶1 000)，4 ℃過夜，次日洗膜，孵育二抗(1∶5 000)，電子凝膠成像系統顯影、拍照，Image J軟件進行蛋白條帶定量分析，以β-actin為內參，以目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值表示目的蛋白相對表達量。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 牙周炎模型效果評價

建模3個月后，實驗組大鼠牙齦呈深紅或暗紅色，伴輕到重度水腫，探診出血甚至溢出齦溝。而對照組大鼠牙齦色粉，質韌，探診無出血。兩組大鼠雙側上頜第二磨牙GBI指數和PPD的測量結果見表1。對照組大鼠3個月時與基線值相比，GBI和PPD差異無統計學意義(P>0.05)，而實驗組大鼠結扎3個月時GBI與PPD較基線時明顯升高(P<0.05)。

表1 大鼠雙側上頜第二磨牙GBI、PPD比較Tab.1 The comparison of GBI and PPD of the bilateral maxillary second molar of rats

使用Micro-CT對大鼠雙側上頜骨進行掃描，使用Micro-CT自帶軟件截取上頜骨矢狀面圖像并進行參數測量。以CEJ至ABC的距離作為牙槽骨吸收的參考標準，計算兩組CEJ-ABC距離數值。與對照組對比，實驗組雙側上頜第二磨牙近遠中牙槽骨出現明顯吸收，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖1)。大鼠牙周炎模型構建成功。

2.2 大鼠睪周脂肪細胞TUNEL染色情況

對照組睪周脂肪細胞中綠色顆粒較少，而實驗組中可見大量綠色顆粒，與對照組相比，實驗組大鼠睪周脂肪細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)(圖2)。

2.3 大鼠睪周脂肪細胞PERK、p-PERK、CHOP蛋白表達水平

與對照組相比，實驗組睪周脂肪細胞PERK蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，但p-PERK、CHOP蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)(圖3)。

2.4 大鼠睪周脂肪細胞中Caspase-12、Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平

與對照組相比，實驗組睪周脂肪細胞中Caspase-12、Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)(圖4)。

3 討 論

慢性牙周炎的主要毒力因子P.gingivalis-LPS[12]可通過破潰的牙周袋內上皮進入血循環到達遠隔器官，從而加重糖尿病、心血管疾病、神經系統疾病等[13-14]。本實驗通過構建牙周炎動物模型，以睪周脂肪組織為代表，探討牙周炎對內臟脂肪組織功能的影響。

牙周袋內注射P.gingivalis-LPS誘導慢性牙周炎是常用的牙周炎動物建模方法，廣泛應用于研究牙周炎與全身健康的關系。本實驗采用該方法構建大鼠牙周炎模型，建模3個月后，實驗組大鼠出現明顯的牙齦紅腫出血、 深牙周袋形成及牙槽骨吸收的癥狀，模擬了人類慢性牙周炎的疾病表型。

既往研究證實，P.gingivalis-LPS是誘導組織細胞凋亡的關鍵毒力因子，可引起全身各種細胞如心肌細胞、骨骼肌細胞、內皮細胞的凋亡，參與糖尿病、心血管類疾病等慢性疾病的發生發展[15-17]。本研究通過P.gingivalis-LPS誘導大鼠慢性牙周炎，采用TUNEL染色及蛋白定量分析技術，發現大鼠睪周脂肪細胞發生凋亡。Lv等[18]體外研究發現，P.gingivalis-LPS也可誘導內臟脂肪細胞的凋亡，加重細胞炎癥反應，與本研究結果一致。

ERS是細胞受到外界刺激時的早期應激反應，在維持內環境的穩態方面發揮重要作用[19]。大量研究證實，ERS可參與調控牙周組織的破壞和細胞壞死，促進牙周炎的發展[20-21]。另一方面，也有文獻報道牙周炎可通過ERS加重對全身系統疾病的作用，如肝臟損傷、糖尿病、動脈粥樣硬化等[22]?？梢?，ERS與牙周炎兩者關系密切。然而，牙周炎能否通過ERS調控內臟脂肪組織的功能，目前尚未見報道。本課題組在前期體外實驗中發現，牙周炎來源的P.gingivalis-LPS可激活內臟脂肪細胞的ERS[6]，提示牙周炎可能存在調控內臟脂肪組織ERS的潛能。在ERS發生過程中，PERK是一個關鍵的信號分子，它的磷酸化激活，可誘導下游蛋白CHOP的表達，最終引發細胞凋亡[23]。Bai等[24]研究也證實P.gingivalis-LPS可激活ERS相關的PERK-CHOP通路誘導牙周膜細胞凋亡。本研究中，實驗組p-PERK表達上調，其下游蛋白CHOP的表達也相應升高，表明P.gingivalis-LPS誘導的慢性牙周炎可導致睪周脂肪細胞PERK-CHOP通路的激活。PERK-CHOP通路激活誘導的細胞凋亡還與Caspase-12及Cleaved-Caspase-3密切相關[25-26]。Caspase-12可通過引起鈣穩態失調激活Caspase-9，繼而裂解Caspase-3，形成Cleaved-Caspase-3[27-29]。而Cleaved-Caspase-3是下游蛋白酶級聯反應的重要啟動因子，其表達進一步加重細胞凋亡[30]。在本研究中，通過檢測睪周脂肪組織發現，Caspase-12和Cleaved-Caspase-3在牙周炎大鼠的表達明顯上調。由此可見，PERK-CHOP通路在牙周炎誘導的睪周脂肪細胞凋亡中發揮了重要作用。

綜上所述，本研究通過構建體內模型證實，P.gingivalis-LPS誘導的牙周炎可調控PERK-CHOP通路，引起Caspase-12和Cleaved-Caspase-3的表達升高，誘導睪周脂肪細胞的凋亡。但P.gingivalis-LPS調控睪周脂肪細胞凋亡的具體機制還需進一步通過體外細胞實驗和體內敲除實驗來驗證。