紫地榆防齲牙膏對牛切牙早期釉質齲的生物礦化作用

徐 磊，李秋艷，王麗梅，藍 海*

（1.大理大學藥學院，云南 大理 671000；2.大理白族自治州人民醫院口腔科，云南 大理 671000）

牙膏作為很多齲齒患者的首選護理產品，既有美容功效又有醫用功效，在清潔牙齒的同時還可以清新口氣，并抵抗齲齒的進程和細菌斑塊的積聚〔1〕。目前市場上的消炎牙膏長期使用易導致口腔菌群失調〔2〕，天然中草藥產品因其價廉且不良反應較少而廣受消費者歡迎〔3〕。本研究將紫地榆提取物不同部位添加到牙膏基質中，觀察其對主要口腔致齲菌生長的抑制作用，評估含紫地榆提取物不同部位的牙膏對釉質齲的抵抗力及再礦化能力〔4〕。

1 材料與儀器

紫地榆，購于大理藥材市場，經大理大學藥學院生藥學教研室楊月娥高級實驗師鑒定為紫地榆Geranium strictipes R.Kunth的干燥根；變形鏈球菌（Streptococcus mutans）ATCC25175、黏 性 放 線 菌（Actinomyces viscosus）ATCC27044購自廣東微生物菌種保藏中心；新鮮牛切牙購自大理市泰興市場；人工唾液（ISO/TR10271，中性，上海源葉生物科技有限公司）；脫礦液（2.2 mmol/L氯化鈣，2.2 mmol/L磷酸二氫鉀，0.05 mmol/L乙酸，pH=4.5）。

ZQX-1402MCD自動轉塔數顯顯微維氏硬度計（依工測試測量儀器上海有限公司）；S-3400N掃描電子顯微鏡（SEM，日立高新技術公司）；體視顯微鏡（重慶光學儀器廠）。

2 方法

2.1 紫地榆有效部位的制備稱取紫地榆粗粉2 kg，置于4 L 95%乙醇中，在50℃下回流提取6次，2 h/次，抽濾，使用旋轉蒸發儀將濾液旋蒸成浸膏后加適量蒸餾水溶解，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等溶劑萃取。舍去石油醚部位，其余部位提取物置于冷凍干燥機制得凍干粉備用〔5〕。乙酸乙酯部位得粉末230 g，正丁醇部位得粉末190 g。

2.2 紫地榆防齲牙膏制備紫地榆防齲牙膏配方：羧甲基纖維素鈉（CMC）0.5 g，角叉萊膠0.8 g，甘油15.0 g，山梨醇8.0 g，乙酸乙酯部位/正丁醇部位4.0 g，二水合磷酸氫鈣42.0 g，水合硅石3.0 g，薄荷油1.0 g，十二烷基硫酸鈉（SDS）2.2 g，尼泊金乙酯0.1 g，尼泊金丙酯0.05 g，低聚異麥芽糖（IMO）0.4 g，加水至100 g。制備過程：稱取增稠劑（CMC和角叉萊膠），加入甘油和70%山梨醇攪拌，調節溫度75~85℃，使其均勻分散，再加入水溶液（IMO、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯預先分散于去離子水中），攪拌成溶膠狀，陳化2 h；攪拌下加入磨擦劑（二水合磷酸氫鈣、SDS），攪拌2 h；加入薄荷油及紫地榆提取物，攪拌陳化2 h即可〔6〕。

2.3 紫地榆防齲牙膏對致齲菌最低抑菌濃度（MIC）的測定

2.3.1 實驗菌株復蘇及菌液制備 在37℃、厭氧條件下TPY固體培養基培養48 h復蘇菌種，于體視顯微鏡下觀察無雜菌，在相同條件下培養18 h增菌，取菌液于低速離心機1 200 r/min離心2 min，取沉積菌加無菌0.9%氯化鈉溶液，使用0.5麥氏比濁管調整菌液濃度為108CFU/mL〔7〕。

2.3.2 MIC的測定 將紫地榆乙酸乙酯部位牙膏、紫地榆正丁醇部位牙膏和空白牙膏基質溶于TPY液體培養基，用二倍稀釋法調整藥液濃度為16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 mg/mL，每個培養基中加入配制的藥液2 mL和菌液20 μL，在37℃厭氧條件下培養48 h，肉眼觀察無菌落生長的藥液濃度為MIC〔8〕。

2.4 牙釉質標本的制備將新鮮牛牙剔除軟組織，洗凈，選取無裂痕、齲損、氟斑的牙齒50顆，用切割機切掉牙根，超聲洗滌40 min，用磨拋機將牙釉質打磨至釉質面呈鏡面狀為宜，在其表面開窗4 mm×4 mm，蒸餾水洗凈并晾干備用。

2.5 牙釉質硬度的測量

2.5.1 脫礦 將上述牙釉質浸泡在脫礦液中，置于37℃的恒溫培養箱中10 d，每5天換1次脫礦液〔9〕。

2.5.2 再礦化 將脫礦后的牙釉質樣本沖洗并吹干，隨機分成5組（n=10），分別為空白牙膏基質組、乙酸乙酯部位牙膏組、正丁醇部位牙膏組、NaF牙膏組和去離子水組。其中前4組分別取空白牙膏基質、乙酸乙酯部位牙膏、正丁醇部位牙膏、NaF牙膏各25 g，加40 mL去離子水，攪拌至勻漿，將4組牙釉質標本浸泡于牙膏漿保持3 min，取出后再浸于37℃人工唾液，間隔12 h重復1次該步驟，每天換液，重復12 d。去離子水組牙釉質標本不做任何處理，浸于37℃人工唾液，每天換液，重復12 d〔10〕。

2.5.3 牙釉質硬度測量 將“2.4”項中牙釉質標本置于鑲嵌機中鑲嵌，用顯微硬度計在開窗區平面隨機測量6個點的表面顯微硬度值（SMH），每個點測5次，分別去掉1個最大值和1個最小值，得到的平均硬度值為基線硬度值〔11〕，記為SMH0。取出脫礦后的牙釉質，沖洗，吹干，按上述方法測量硬度值，記為SMH1；再礦化后的牙釉質，沖洗，吹干，用相同方法測量硬度值，記為SMH2。按下面公式計算表面顯微硬度恢復率（SMHR）：

SMHR（%）=（SMH2-SMH1）/（SMH0-SMH1）×100%。

2.6 SEM觀察牙釉質表面形貌隨機抽取脫礦前、脫礦后和再礦化后的釉質標本，經2次真空干燥、噴金屬鉑觀察各組釉質表面形態的變化。

2.7 統計分析采用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用SNK-q檢驗，組內比較采用配對t檢驗（α=0.05），P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 紫地榆提取物不同部位牙膏抑菌作用結果抑菌實驗結果顯示紫地榆乙酸乙酯部位牙膏稀釋液和紫地榆正丁醇部位牙膏稀釋液對變形鏈球菌和黏性放線菌的MIC均為4.000 mg/mL?？瞻籽栏嗷|稀釋液對變形鏈球菌和黏性放線菌無明顯的抑菌作用。

3.2 硬度測量結果選取基線值SMH0差異無統計學意義（P>0.05）的牙釉質進行平行脫礦實驗。各組脫礦后牙釉質硬度明顯減小，與脫礦前的牙釉質硬度相比差異有統計學意義（P＜0.05）；再礦化后NaF牙膏組、乙酸乙酯部位牙膏組的硬度值明顯恢復到脫礦前的硬度，且SMHR為：NaF牙膏組＞乙酸乙酯部位牙膏組＞正丁醇部位牙膏組＞空白牙膏基質組＞去離子水組，與去離子水組比較，乙酸乙酯部位牙膏組和正丁醇部位牙膏組的SMHR較高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組再礦化前后SMH比較（±s）

表1 各組再礦化前后SMH比較（±s）

注：與SMH0比較*P＜0.05；與SMH1比較#P＜0.05；與空白牙膏基質組比較△P＜0.05；與NaF牙膏組比較○P＜0.05；與去離子水組比較□P＜0.05。

組別 SMH0 SMH1 SMH2 SMHR/%空白牙膏基質乙酯部位牙組 350.70±15.81 270.07±16.85* 311.73±5.58*# 52±36.89○乙酸膏組 357.70±5.56 270.40±28.25* 355.23±8.90# 97±45.61△○□正丁醇部位牙膏組 356.50±13.06 273.97±17.89* 345.80±3.14# 87±40.45△○□NaF牙膏組 359.63±6.31 271.10±38.07* 400.40±14.90*# 146±60.87△□去離子水組 351.93±36.52 272.63±7.24* 298.93±8.83# 33±39.87○

3.3 SEM測量結果經空白牙膏基質稀釋液處理后的牙釉質表面，結構較脫礦后和去離子水組致密，表面不平整，見圖1A；經紫地榆乙酸乙酯部位牙膏稀釋液和紫地榆正丁醇部位牙膏稀釋液處理后的牙釉質表面無明顯腔隙，致密，存在少量的沉淀物，見圖1B~C；經NaF牙膏稀釋液處理后的牙釉質表面存在大量球狀沉積物，見圖1D；去離子水組牙釉質表面凹凸不平，存在少量沉積物，見圖1E；脫礦前牙釉質表面平整光滑無明顯腔隙，而脫礦后牙釉質表面凹凸不平，存在鱗狀凸起，表面疏松，見圖1F～G。

4 討論

齲病是一種慢性牙體硬組織進行性破壞性疾病，是人類最為常見的口腔疾病，通常與變形鏈球菌和黏性放線菌等主要致齲菌過度生長有關〔12〕。因此本實驗選擇變形鏈球菌和黏性放線菌這兩種致齲菌作為實驗菌?？紤]本實驗所制備的牙膏配方中含有薄荷油成分，可能具有協同抑菌作用，因此增加空白牙膏基質對口腔主要致齲菌的MIC測定實驗，但并未檢測出其協同抑菌作用。

牙釉質硬度在脫礦后下降，使用紫地榆提取物牙膏后牙釉質表面硬度有所提高，說明紫地榆提取物牙膏具有牙釉質再礦化的作用〔13〕。SEM圖像結果顯示，脫礦后牙釉質表面存在腔隙，結構疏松，空白牙膏基質組和去離子水組牙釉質表面也較致密并存在少量沉積物，可能是因為經過人工唾液處理后，產生磷酸鈣沉積物附著于牙釉質表面，修復少量腔隙〔14〕。而紫地榆提取物牙膏組較空白牙膏基質組和去離子水組牙釉質表面更平整、更致密，說明紫地榆提取物能有效修復脫礦的牙釉質。NaF牙膏組是由于氟化物促進鈣磷離子結合生成穩定的氟磷灰石，在表面大量沉積〔15〕。

綜上所述，紫地榆提取物牙膏稀釋液對兩種致齲菌均有抑制作用，且對牙釉質具有促進再礦化的作用，證明中藥紫地榆具有修復齲齒的效果。