添加IGF-1 對體外培養不同直徑豬卵泡中卵母細胞成熟率的影響

劉子嶷，李凱揚，王 鵬，李文韜，周祖陽，孫小勇，劉玉芳*

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056001；2.北京市畜牧總站，北京 100107；3.北京大學醫學部實驗動物科學部，北京 100191）

豬作為常見實驗動物模型，具有高繁殖潛力和維護成本低的特點[1]。卵母細胞體外成熟培養（IVM）作為產生豬胚胎的方式之一在生物醫學和農業應用中越來越重要[2-4]。IVM 通過判斷第一極體排出作為篩選成熟卵母細胞的主要標志[5]。此外，卵母細胞的發育離不開卵丘細胞，卵丘細胞在卵母細胞生長和成熟過程不斷提供營養，并介導激素對卵丘-卵母細胞復合體（COCs）產生影響[6-7]。卵丘擴張在卵母細胞成熟過程中也起著重要作用，卵丘越擴張說明卵母細胞發育潛力越大[8]。卵母細胞成熟過程中胞核和胞質的變化是顯示卵母細胞發育能力的關鍵，卵母細胞內谷胱甘肽（GSH）含量也被用作細胞質成熟的指標，較高的GSH 水平與原核形成呈正相關[9-10]。以往研究者進行了大量試驗來提高豬卵母細胞體外成熟率，如在成熟培養液中添加不同成分以促進其發育成熟[4,11-13]。

研究發現，胰島素和胰島素樣生長因子（IGFs）等多肽生長因子參與卵巢的生理功能，發揮積極作用[14-15]。胰島素樣生長因子-1（IGF-1）是一種結構和功能上與胰島素密切相關的單鏈血清肽[16]，可促進細胞增殖、芳香化酶活性和孕酮生物合成[17]。研究發現IGF-1 可由豬卵泡和顆粒細胞釋放，培養基中添加IGF-1 可刺激豬卵母細胞的減數分裂和體外成熟[18]。研究證明，在豬卵母細胞體外成熟培養液中添加不同濃度IGF-1（10～80 ng/mL）均可以促進細胞核成熟[19]。另有研究報道，較大直徑卵泡內的卵母細胞體外成熟率較高，且能提供較好的體外胚胎[20]。為深入了解IGF-1 對豬卵母細胞體外培養成熟率的影響，本研究評估了IGF-1對豬不同直徑卵泡中卵母細胞IVM 的影響，并檢測了卵母細胞中谷胱甘肽（GSH）和活性氧（ROS）含量，以期探究添加外源IGF-1 對3 種直徑卵泡卵母細胞成熟的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及培養液的配置

1.1.1 主要試劑 氯化鈉（NaCl）、牛血清白蛋白（BSA）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、葡萄糖（D-Glucose）、聚乙烯醇（PVA）、卵泡刺激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、丙酮酸鈉（Na-Pyruvate）青霉素、鏈霉素均購自Sigma 公司（美國），表皮細胞生長因子（EGF）、IGF-1 均購自Novoprotein 公司（上海），透明質酸酶、石蠟油、多聚甲醛均購自Solarbio公司（北京），Medium 199 購自Gibco 公司（美國），Hochest 33342 購自Invitrogen 公司（美國）。

1.1.2 培養液的配置 洗卵液：3.3315 g NaCl+1.5 g BSA+1.1915 g Hepes+0.084 g NaHCO3，徹底溶解于滅菌純化水。

成熟培養基礎液：0.015 g NaHCO3+0.0275 gDGlucose+0.005 g Na-Pyruvate+0.05 g PVA+0.033 g 青霉素+0.025g 鏈霉素，徹底溶解于50 mL Medium199。

成熟培養工作液：基礎液+4.4 μL FSH+4.4 μL LH+4 μL EGF+400 μL 豬卵泡液。

將配好的成熟培養工作液過濾后加入到四孔板中，每孔700 μL，覆蓋石蠟油。置于39℃，5% CO2，飽和濕度的培養箱平衡2 h。100 μL 成熟培養工作液制作洗滴并用石蠟油覆蓋，放培養箱平衡2 h。每個滴20～30個COCs，每個孔50 個COCs。

1.2 卵巢采集及處理 于屠宰場收集豬卵巢置于保溫桶中，浸泡于30～38℃含雙抗（青、鏈霉素）的滅菌生理鹽水中，4 h 內送回實驗室。用加入雙抗的37℃生理鹽水沖洗卵巢3～5 次，剪去卵巢上多余的結締組織。

1.3 卵母細胞收集 按照卵泡直徑分別收集2～3、3～5 mm和5～8 mm 3 組COCs，用注射器分別抽取卵泡液置于滅菌離心管中，37℃靜置15 min 至細胞沉淀，用抽卵針在顯微鏡下按照分組分別挑出胞質完整均勻且卵丘在3～5 層的COCs，用洗卵液洗3 遍。

1.4 卵母細胞成熟培養 挑選符合要求的COCs 在預熱的洗滴中洗3 遍，最后轉入四孔板中。在39℃，5%CO2，飽和濕度下體外培養卵母細胞成熟，48 h 后統計卵丘擴散率。再將細胞移至0.2%透明質酸酶中脫去卵丘細胞，裸卵用4%多聚甲醛固定1 h 后PBS 洗3 遍，用Hochest 33342 避光染色5 min，再用PBS 洗3 次后，顯微鏡下觀察統計第一極體的排出率。

1.5 實驗設計

1.5.1 IGF-1 對卵母細胞成熟的影響 在成熟培養工作液的基礎上+30 ng/mL IGF-1 進行體外培養，設置對照組，統計其卵丘擴展率和第一極體排出率，判定添加IGF-1 能否影響豬卵母細胞成熟率。

1.5.2 IGF-1 對不同直徑卵母細胞成熟的影響 根據不同直徑卵泡（2～3、3～5 mm 和5～8 mm）進行分組，分別添加IGF-1 的成熟培養工作液進行體外培養，統計其卵丘擴展率和第一極體排出率，判定IGF-1 是否影響不同直徑卵泡卵母細胞的成熟。

1.6 卵母細胞中GSH 的檢測 在成熟培養的44 h 取COCs，用0.2% 透明質酸酶去除卵丘細胞，采用碧云天試劑盒S0052（碧云天生物技術有限公司，北京）對卵母細胞中GSH 的含量進行檢測。每組30 枚卵母細胞移入新鮮配制的10 μL 蛋白去除試劑M 中，在液氮和37℃水浴鍋中反復凍融3 次，使用酶標儀進行標準品與樣品吸光值的檢測。采用動力學測定法繪制標準曲線：取某一濃度GSH 的標準樣品與GSH 檢測工作液混合，測定405 nm 處樣品吸光值。以不同GSH 標準濃度為橫坐標x，以與其對應濃度下OD412 吸光值為縱坐標y，繪制標準曲線，據曲線方程計算卵母細胞中GSH 含量。所有實驗重復3 次，顯示的數值為平均值±標準誤。

1.7 卵母細胞中ROS 的檢測 在成熟培養的44 h 后取COCs，用0.2%透明質酸酶去除卵丘細胞，根據碧云天S0033 試劑盒（碧云天生物技術有限公司，北京）說明，按照1:1000 用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 mol/L。將卵母細胞懸浮于稀釋好的DCFH-DA 中，置于37℃細胞培養箱內孵育20 min。每隔5 min 顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養液洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。直接用ROS 陽性對照刺激細胞30 min。使用488 nm激發波長，525 nm 發射波長，檢測刺激前后熒光的強弱，用Image J 進行分析。所有實驗重復3 次，顯示的數值為平均值±標準誤

1.8 統計分析 所得數據用SPSS 軟件通過卡方檢驗進行差異顯著性檢驗，使用LSD 法和Duncan's 法進行多重比較。結果以平均值± 標準誤表示，P＞0.05 為差異不顯著，P＜0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 卵母細胞體外成熟培養 經過44 h 體外成熟培養，大部分COCs 擴展面積明顯增大（圖1）。在IVM 前形態較好的卵母細胞，其周圍卵丘細胞排列緊密，整個卵母細胞被卵丘細胞完全包裹。IVM 過程中COCs 逐步伸展，卵丘細胞之間的間隙變大，卵母細胞中央生發泡發生破裂，IVM 后44 h COCs 變得更加舒展，用0.2%透明質酸酶處理后得到卵母細胞，用顯微鏡觀察到卵母細胞卵周間隙中第一極體（PbI）的排出（圖2）。

圖1 3～5 層卵丘的COC（左）與培養44 h 卵丘擴展的COC（右）

圖2 卵母細胞第一極體排出

2.2 IGF-1 對卵母細胞體外成熟的影響 COC 體外成熟培養44 h 后，觀察到卵丘層大部分擴展且面積變為初始5 倍左右大小，可說明該COC 整體擴展效果較好[21]。結果發現，添加IGF-1 組COC 擴展數為356 個，擴展率為92.0%；對照組有295 個擴展，擴展率為87.5%，添加組的擴展率高于對照組（P＜0.05）。從第一極體排出情況來看，添加組排出數為152，對照組排出數為108，添加IGF-1 和對照組的第一極體排出率分別為39.3%和32.0%（P＜0.05）（表1）。

表1 添加IGF-1 進行卵母細胞體外培養的卵丘擴展數和第一極體排出數

2.3 IGF-1 對豬不同直徑卵泡中卵母細胞成熟的影響添加IGF-1 成熟培養組中卵丘細胞擴展率為3～5 mm 組＞5～8 mm 組＞2～3 mm 組（P＞0.05），第一極體排出率為3～5mm 組＞5～8 mm 組＞2～3 mm 組（P＜0.05）（表2）。

表2 豬不同直徑卵泡卵母細胞體外培養中添加IGF-1卵丘擴展率和第一極體排出率

將337 個未添加外源IGF-1 的COC 也分別按照3種卵泡直徑進行體外成熟培養，設置為對照組，結果如表3 所示，5～8 mm 組卵丘擴展率最高（89.9%），其次是3～5 mm 組（89.3%），2～3 mm 組最低（82.1%）且與上述2 組間差異顯著，但3～5 mm 和5～8 mm 差異不顯著。5～8 mm 組第一極體排出率最高（40.8%），其次是3～5 mm 組（34.5%），最低是2～3 mm 組（18.9%），3 組間差異顯著。添加組3～5 mm 的卵丘擴展率和第一極體排出率為最高。

表3 豬不同直徑卵泡卵母細胞體外培養中未添加IGF-1卵丘擴展率和第一極體排出率

2.4 GSH 含量檢測 按照總谷胱甘肽試劑盒說明書操作，先用GSH 標準品繪制標準曲線（圖3），以總谷胱甘肽標準品含量為橫坐標x，405 nm 吸光值為縱坐標y，繪制標準曲線，得出方程y=0.1354x+0.1195，其中R2=0.998 7～0.990 0，吻合程度較高。

圖3 GSH 標準曲線

如表4 所示，與對照組相比，添加IGF-1 組GSH含量較高（P＜0.05）。由表5 可知，添加IGF-1 組中各直徑卵母細胞GSH 含量為5～8 mm 組與3～5 mm 組顯著高于2～3 mm 組，前2 組間無顯著差異。

表4 添加IGF-1 和對照組卵母細胞體外成熟培養44 h 測定GSH 含量

表5 豬不同直徑卵泡卵母細胞體外成熟培養液添加IGF-1 的GSH 含量

由表6 可知，未添加IGF-1 組中，3 種直徑卵泡來源卵母細胞在培養44 h 后GSH 含量差異不顯著。

表6 豬不同直徑卵泡卵母細胞體外成熟培養液未添加IGF-1 的GSH 含量

2.5 卵母細胞ROS 的檢測 如表7 所示，在添加IGF-1組中，5～8 mm 卵泡卵母細胞體外培養，其ROS 平均熒光強度為0.201，而2～3 mm 的熒光強度最高為0.376。3～5 mm 和5～8 mm 組間差異不顯著，但與2～3 mm 組差異顯著。如表8 所示，3 種直徑卵泡來源卵母細胞在培養44 h 后ROS 熒光強度差異不顯著。

表7 豬不同直徑卵泡中卵母細胞體外成熟培養液添加IGF-1 的ROS 熒光強度

表8 豬不同直徑卵泡中卵母細胞體外成熟培養液未添加IGF-1 的ROS 熒光強度

3 討 論

生長因子在卵母細胞成熟和卵泡發育過程中起重要作用，它們可能是促進卵泡內卵母細胞成熟的決定性因素[22]。IGF-1 在體內協同促性腺激素，類固醇激素和其他的分子調節卵泡發育，同時IGF-1 也能促進卵母細胞體外核成熟，這一結果有助于詮釋調節卵母細胞體外成熟的因子的作用機制[23]。Sato 等[24]證實了添加IGF-1對犬卵母細胞成熟率和卵丘擴張有積極的影響，但是需要較高水平的IGF-1（50 μg/mL）。在牛卵母細胞發育相關研究中發現，IGF-1（100 ng/mL）已被證明能刺激牛卵母細胞的卵丘擴張和核成熟[25]。卵丘擴張是反映卵母細胞成熟以及隨后的發育能力的一個指標[26]。本研究通過對第一極體排出、GSH 含量測定分析，發現添加IGF-1 后對豬卵母細胞體外成熟率顯著優于未添加組，表明添加IGF-1 可以促進豬卵母細胞體外成熟。

在哺乳動物的研究中，卵泡大小對卵母細胞成熟、排卵及人工授精具有重要意義[27]。目前，用于體外胚胎研究的卵母細胞通常取自直徑3～6 mm 卵泡，但卵巢中存在大量直徑小于3 mm 的卵泡[28]。為獲得小于3 mm 卵泡卵母細胞體外成熟情況，Yoon 等[29]研究發現直徑小于3 mm 的豬卵泡卵母細胞體外發育能力明顯弱于直徑大于3 mm 的卵泡。本研究統計了添加IGF-1 體外成熟44 h 后不同直徑的成熟率，發現直徑為3～5 mm的COCs 卵丘擴展率顯著比2～3 mm 和5～8 mm 高，第一極體排出率最高為3～5 mm（46.9%），證明添加外源IGF-1 后3～5 mm 卵泡卵母細胞成熟率較高。

卵母細胞生長發育過程中活性氧的產生會導致DNA損傷和線粒體功能障礙，影響卵母細胞的發育[30-31]。而在IVM 過程中，ROS 產生量比體內成熟的產生量多，過多的ROS 會使卵母細胞退化，影響成熟效率，而GSH 可保護細胞免受ROS 損害[32]。GSH 在卵母細胞體外成熟過程中協助卵母細胞抵抗氧壓力，參與氨基酸轉運，為蛋白合成提供原料，保障DNA 和蛋白合成所需的能量、協助微管合成，影響紡錘體的形態，在卵母細胞中起到重要作用[33]。因此，卵母細胞內GSH 含量也是衡量卵母細胞成熟質量的關鍵指標[34]。本研究中添加組5～8mm 卵泡COCs 中GSH 含量最高，但僅與2～3 mm 組差異顯著，而未添加組的3 種直徑間差異不顯著。檢測ROS 結果可知，添加組5～8 mm 平均熒光強度最低，而2～3 mm 的熒光強度最高，5～8 mm 與2～3 mm 組差異顯著，但與3～5 mm 差異不顯著。未添加組中三種直徑間ROS 差異不顯著。

4 小 結

綜上所述，經過對豬不同直徑卵泡中COCs 44 h 體外成熟培養，比較卵丘擴展、第一極體、GSH 和ROS含量來看，添加IGF-1 使3～5 mm 卵泡卵丘擴展率和第一極體排出率增高。同時添加組3～5 mm 和5～8 mm 中GSH 顯著降低了卵母細胞ROS 水平，改善卵母細胞氧化還原狀態。