血液系統腫瘤研究中單細胞測序技術的應用

劉細細綜述；陳碧清，朱學軍審閱（.南京中醫藥大學附屬醫院、第一臨床醫學院，江蘇 南京 009；.南京中醫藥大學附屬醫院中心實驗室，江蘇 南京 009；.南京中醫藥大學附屬醫院 血液科，江蘇 南京 009）

血液系統惡性腫瘤是一組危及生命的異質性血液疾病。血液腫瘤細胞亞群的異質性和克隆演變是疾病精確診斷、風險分層，乃至靶向治療的主要障礙[1]。傳統的異質性研究主要使用流式細胞術來鑒別血液中的各類型細胞，但是這種方法嚴重依賴于熒光標記的細胞膜表面分子標志物，而現有可用的分子標志物十分有限，而且很多胞內分子標志物無法檢測。近年來新興的單細胞測序技術很好地解決了這一問題，為細胞異質性的研究提供了有力的平臺。單細胞測序在腫瘤研究等領域發揮著重要作用，正成為生命科學研究的焦點[2]。應用以單細胞轉錄組測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）為主的單細胞測序技術來研究血液腫瘤，可以了解腫瘤細胞在基因表達水平的異質性，有助于實現更準確的疾病監測和分層、闡明疾病發生和發展的分子機制及制定精準的治療方案[3]。

1 化解腫瘤異質性難題

腫瘤組織樣本中的細胞具有異質性。單細胞測序技術已廣泛應用于腫瘤方向的研究，但是受限于腫瘤細胞沒有明確的分子標記基因，很難直接通過轉錄組數據中的基因表達水平從腫瘤組織中區分正常細胞和惡性腫瘤細胞[4]?；趕cRNA-seq 數據進行單細胞拷貝數變異分析，就是利用不同樣本或不同細胞類型之間的基因表達量預測大規模染色體水平的拷貝數變異，發現拷貝數異常的細胞，從而幫助區分腫瘤惡性細胞，為腫瘤異質性、克隆進化的研究奠定基礎[5-6]。PETTI 等[7]通過全基因組測序與scRNAseq相結合的方法，將急性髓系白血病細胞（包括正常核型的白血病細胞）與正常細胞區分開來，識別與亞克隆突變相關的表達特征，并找到可用于純化亞克隆以進行進一步研究的細胞表面標志物。

腫瘤細胞具有高度異質性，并隨時間發生演變[8]。有研究[9]表明，腫瘤干細胞不是單克隆群體，而是由不同的惡性細胞亞群組成，這導致了腫瘤內的異質性。HALBRITTER 等[10]通過scRNA-seq 制作了詳細的朗格漢斯細胞組織細胞增生癥（langerhans cell histiocgtosis，LCH）的病變分子及細胞圖譜，并利用數據庫中單細胞高分辨率研究了LCH細胞間的異質性，證實LCH病變中存在的復雜發育層次，為LCH個性化治療提供了新的方向。GUPTA 等[11]利用scRNA-seq分析技術，同時分析數百萬兒童白血病細胞的表型和信號特征，識別出六種類型的惡性細胞，這些發現有助于精準診療和開展免疫療法。

腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）具有異質性。TME 的異質性與腫瘤的發生和發展密切相關[12]。TME是由非腫瘤基質細胞構成,包括免疫細胞、成纖維細胞、內皮細胞等，其通過與腫瘤細胞之間的相互作用來影響腫瘤的發生發展[13]。免疫細胞的浸潤牽涉到多種細胞的參與，這些細胞群可能具有促進腫瘤生成或抗腫瘤的作用。識別免疫細胞的異質性是導致腫瘤治療失敗和腫瘤演進的關鍵因素[14-15]。VILLANI 等[16]通過scRNA-seq 在外周血單個核細胞中發現了新型樹突狀細胞、單核細胞和祖細胞，將實現更準確的功能和發育分析及健康和疾病的免疫監測。BARYAWNO 等[17]使用scRNA-seq 技術定義了小鼠骨髓基質中17個不同的細胞亞群及其基因特征，發現了在穩態造血中表達關鍵生態位因子的基質細胞，揭示了急性髓系白血病擾亂間充質干細胞分化、損害正常造血功能的致病機制。為探究濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）的潛在轉錄網絡，ANDOR等[18]分析了6個原發性FL患者的34 188個細胞的轉錄本，通過基因表達鑒別每一個腫瘤的正常的免疫亞群和惡性B細胞，揭示淋巴瘤與T細胞免疫檢查點的共表達基因。

2 探究腫瘤發生發展和治療耐藥性的分子機制

血液腫瘤的高度異質性是病情進展和出現耐藥性的主要因素[19-20]?，F階段大多數治療手段沒有靶向腫瘤異質性，而是將腫瘤當作同質的群體，從而導致腫瘤藥物治療失敗?；颊咴诮邮芑熀蟮木徑馄诳尚纬尚峦蛔兗霸黾涌寺∵M化概率，進而導致復發，而復發與不良預后有關，故了解耐藥的分子機制有助于減少疾病復發率、提高治愈率。BELL 等[21]應用scRNA-seq 監測急性髓系白血病的幼稚細胞對BET抑制劑耐藥過程的轉錄軌跡，發現耐藥出現在表觀遺傳層面，而不是遺傳層面，轉錄層面不斷動態地出現適應性改變。BUUS 等[22]利用scRNA-seq 發現了一些組蛋白去乙?；敢种苿┲委烻ézary 綜合征耐藥的惡性細胞亞群。同時，scRNA-seq 提供了一種在單細胞水平上區分不同惡性細胞亞群變化的針對性方法，可以幫助設計新療法來對抗耐藥性。COHEN等[23]通過scRNA-seq 發現肽基脯氨酰異構酶A 是多發性骨髓瘤耐藥的潛在有效治療新靶點。

了解一個正常的造血細胞如何發展成一個潛在的惡性腫瘤干細胞并最終導致血液惡性腫瘤，有助于認識克隆演變的過程以及腫瘤耐藥復發的分子機制。單細胞測序可以用來檢測腫瘤異質性、發現疾病治療過程中由于克隆演變引起的耐藥及復發相關的惡性克隆。由于個體患者的惡性克隆具有異質性且處于不斷演變中，運用單細胞測序方法相比于傳統統一標準化治療方案而言，可以更詳細地了解血液腫瘤細胞亞群的基因組結構和克隆進化，促進血液腫瘤的個體化靶向治療的實現[24]。ADELMAN等[25]研究者通過對急性髓系白血病患者的造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）的單細胞測序分析發現，人類HSC 的表觀遺傳重編程隨著年齡的增長而增加，這些表觀遺傳改變的基因表達水平下調，繼而導致了分化受損，表明髓系惡性腫瘤的風險增加與衰老和HSC的功能衰退有關。

3 探索更精細層次的標志物

疾病狀態的無創監測、早期進展預測、治療反應評估和復發的早期發現均依賴于分子標志物，單細胞測序技術為發現新的分子標志物提供了可靠工具。多發性骨髓瘤通過血液轉移時會在外周血中殘留微量的循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC），這些CTC 的遺傳信息與骨髓中的骨髓瘤細胞相同，具有相似的異質性[26]。LOHR 等[27]應用scRNA-seq 分析了從2 名多發性骨髓瘤患者的骨髓和外周血中收集的骨髓瘤細胞和B 細胞，發現可以通過CD45、CD27 和CD56 標記物來區分CTC。區分這些CTC 的分子特征可建立腫瘤克隆之間的相關性。因此，對外周血中的CTC應用單細胞測序可在臨床環境中監測多發性骨髓瘤，定量評估與預后和治療相關的基因，并且在揭示突變方面甚至比骨髓活檢更敏感。這些研究結果揭示了單細胞測序結合CTC取代骨髓活檢的潛力，可以廣泛應用于更多涉及活檢的血液腫瘤疾病。LEDERGOR 等[28]利用scRNA-seq 對從正常漿細胞到多發性骨髓瘤的整個臨床進展譜進行敏感表征，在早期無癥狀和治療后有微小殘留病灶（mininal residual disease，MRD）的患者中，能夠靈敏而精確地檢測罕見的殘留腫瘤細胞，其分子特征與活動期骨髓瘤相似，這可能為個體化治療提供依據。ZHU等[29]通過對T淋巴細胞急性白血病小鼠模型的scRNA-seq，確定了一個白血病干細胞特異性表達的調控因子SPI1，該基因決定了白血病干細胞的分子特征和活性，可作為急性白血病治療的潛在新靶點。GAYDOSIK 等[30]則通過對比探究侵襲性皮膚T 細胞淋巴瘤的基因表達異質性，揭示了PCNA、ATP5C1、NUSPA1和TOX基因的共表達模式可作為該疾病的晚期診斷分子標志物。

單細胞測序使得研究者能夠獲得患者來源的腫瘤細胞的無偏性基因表達譜，可以前瞻性地識別腫瘤進展過程中最重要的基因或受影響的分子通路，為精準診斷和疾病風險分層、預測患者的進展風險提供了更多分子標簽，有助于制定相對應的個體化治療方案。已有利用單細胞測序鑒定急性髓系白血病骨髓中各亞型細胞的基因表達譜[31]，以及輔助多發性骨髓瘤的分期和定量評估預后基因的實例[27]。JANG 等[32]通過單細胞測序數據分析將骨髓活檢中的CD138陽性細胞分為4組，對應于遞增的多發性骨髓瘤進展風險水平，并證明了氧化磷酸化、Myc 靶點和mTORC1 信號通路的高表達與腫瘤進展相關。ZHANG 等[33]通過scRNA-seq 對B-ALL 細胞進行識別，并縱向分析了診斷階段、治療階段到復發階段的腫瘤細胞分化狀態，發現了缺氧信號通路這一有價值的治療MRD 的靶點，深入了解了MRD 細胞的轉錄組特征，為其他血液系統惡性腫瘤和實體癌癥的治療提供了研究思路。

4 精準區分惡性血液腫瘤種類及測評預后

血液惡性腫瘤包括各種形式的白血病、淋巴瘤和多發性骨髓瘤等，其中大部分血液腫瘤的發病機制均涉及多種基因突變引起的異?；虮磉_[34]。鑒于惡性血液病的不同種類疾病、不同患者群體、疾病不同階段的巨大差異[35]，scRNA-seq 能夠進行更精準的區分疾病種類、危度分層，從而制定并及時改善治療方案[36]。有研究[37-38]發現，利用scRNA-seq在骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）患者體內也檢測到TP53 突變，但該突變在不同的惡性血液?。ˋML、CLL、ALL）中具有異質性，這對MDS 精準化診斷具有重要意義。FRAWLEY 等[39]利用scRNA-seq 對JAK2、MPL、CALR 基因進行測序，有助于提高骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）患者的檢出率，為傳統的MPN 突變基因篩選提供一種穩健的解決方案。KUENDGEN等[40]運用scRNA-seq 檢測了多名使用阿扎胞苷治療MDS 患者的常見突變基因（ASXL1、RUNX1、DNMT3A、IDH1、IDH2、TET2、TP53、NRAS、KRAS、FLT3、KMT2A-PTD、EZH2、SF3B1、SRSF2），以此來評估阿扎胞苷的遠期療效，并試圖找到能夠反映其預后的指標，發現MPN 患者具有一定風險進展為MDS 或AML。LANGABEER 等[41]利用scRNA-seq 發現攜帶CBLL380P基因突變的患者，盡管沒有JAK2、MPL exon10、CA-LR exon9 突變，但其仍然具有進展為MDS 或AML 的高風險。近年來研究發現t（8;21）AML患者的預后具有異質性，遠期復發率約40%，因此需要對其進行危險分層治療，進一步提高根治率。XIONG 等[42]對2 名t（8;21）AML 患者進行了scRNA-seq 分析，發現可用3 個生物標志物來預測t（8;21）AML的預后。

5 評估臨床試驗有效性和安全性的利器

單細胞測序可識別各類型細胞對藥物或干預處理的響應差異，探索臨床干預的動態調節網絡[43]。近年來，單細胞測序被廣泛用于精細衡量臨床試驗中新藥的有效性和安全性，如監測急性淋巴細胞白血病和淋巴瘤的患者接受治療時外周血中的體細胞突變。ESCOBAR 等[44]通過scRNA-seq 發現，對TME 實施免疫刺激（即IFN 基因治療）可通過單核細胞介導的IFN-α 基因傳遞來抑制模型小鼠的急性淋巴母細胞白血病。嵌合抗原受體（CAR）和T細胞受體（TCR）修飾的T 細胞是當前過繼性細胞治療技術中兩大核心技術，通過工程化編輯使得T細胞表達人工合成受體并具有特異性識別靶細胞的能力，可實現對血液相關腫瘤（如白血病和淋巴瘤）的長期緩解甚至治愈，正在徹底改變癌癥的治療景觀。SHEIH 等[45]通過scRNA-seq 測序鑒定人腦中的CD19 陽性壁細胞，表明正常腦組織中的一小部分壁細胞表達CD19，并被CD19 CAR-T細胞作為靶細胞，該治療可能通過增加腦血管通透性導致神經毒性。scRNA-seq可能提供前所未有的高分辨率表達譜，能夠根據罕見細胞亞群中靶細胞的表達來了解CAR 治療的有效性和安全性。PARKER等[46]通過scRNA-seq分析和免疫組庫測序技術對CAR-T細胞輸注到患者體內前后的克隆型多樣性變化、輸注后不同時期細胞基因表達特征和具體判斷何種細胞類型會有更強的克隆動力進行了深入、細致的探究，為CAR-T細胞的治療效果提升奠定了重要基礎。STADTMAUER等[47]利用單細胞測序探究CRISPR-Cas9編輯的TCR-T細胞在人體臨床試驗的安全性和可行性，了解了基因編輯后細胞突變比例、基因表達及體內動態特征。在細胞免疫治療研究中應用單細胞測序可以區分不同的免疫細胞組，分析浸潤淋巴細胞的不同CAR-T細胞亞型和克隆擴增，從而有助于個性化的一線治療。推進CAR-T細胞療法的一個重要方向是利用scRNA-seq 開發預測臨床結果的生物標志物。目前，CAR-T細胞是使用患者自身的T 細胞生產的，因此CAR-T 質量和個體差異可能有很大關系。單細胞測序研究可以將輸注前將CAR-T 細胞產品中的T 細胞特性與患者反應聯系起來，有助于開發預測療效的生物標志物。

6 結語

結合二代測序技術的單細胞測序分析在揭示免疫細胞異質性和深入理解血液腫瘤發病與耐藥機制、疾病分層、疾病進展監測和靶向治療反應性等方面已經顯示出了良好的實用價值。目前，結合質譜、光譜等其他領域尖端技術的單細胞基因組、單細胞蛋白組等技術手段，以及已擺脫單細胞分離難題的空間轉錄組技術層出不窮，未來這些技術將和scRNA-seq 結合起來，互相補充，共同促進對血液系統腫瘤的生理和病理過程在單個細胞精度和細胞網絡層面上的綜合認知?？梢灶A見的是，未來單細胞測序相關技術將更廣泛地應用于各種血液腫瘤和免疫的研究，助力開發更好的診斷及預后測評的生物標志物，促進設計個體化的抗腫瘤方案，以提高治療效果并避免耐藥性?？傊?，未來單細胞測序的應用將具有深遠和廣闊的臨床前景。