Eps同源結構域蛋白2在惡性腫瘤中作用研究進展

管程齊 綜述；張健鋒 審閱（南通大學附屬醫院 消化內科，江蘇 南通 226001）

Eps 同源結構域蛋白2（Eps15 homology domaincontaining protein 2，EHD2）是動力蛋白相關的EHDATPase 家族中的一員，是新型的膜轉運蛋白。這類蛋白具有高保留的EH 結構域，其序列相似性約50%～60%，富含約100 個氨基酸殘基的片段，最早在上皮細胞生長因子受體的激酶底物Eps15 上被發現[1]，并且廣泛存在于植物和哺乳類動物中[2]。EHD2含有不同的功能區域，特異性調節功能體現在胞膜轉運的不同過程中，有調控循環通路的功能，和一些需要重塑或維持胞膜形狀的細胞過程密切相關，如內吞循環、纖毛發生、骨骼肌T 管形成、質膜修復、脂滴自噬等[3]。它還可通過不同方式與肌動蛋白細胞骨架相聯系，在細胞質膜微囊和肌動蛋白細胞骨架的聯系中起積極作用，尤其是在穩定質膜微囊動力方面[4]。

轉移能力是惡性腫瘤最重要的特征之一[5]，其與胞膜轉運密不可分[6]。胞膜轉運的協調性需一系列蛋白尤其是膜轉運蛋白的共同參與。當EHD2 表達異常時，在膜及膜蛋白的各路循環調節、胞膜的轉運等過程中均會發生信號應答失當，各類細胞過程（如細胞黏附、細胞遷移、胞質分裂）出現紊亂，從而引發腫瘤的發生發展[7]。既往研究表明，EHD2 與各類惡性腫瘤，如乳腺癌[8]、肝癌[9]、食管鱗癌[10]、甲狀腺乳頭癌[11]、腎透明細胞癌[12]、骨肉瘤[13]等密切相關，參與調控腫瘤的生長、轉移、侵襲。本文就目前已報道的EHD2在腫瘤發生發展中的作用及其調控機制、在疾病診療中的意義做一綜述，旨在為尋找新的腫瘤診斷標志物和治療靶點提供參考依據。

1 EHD2蛋白與腫瘤相關的結構和功能特征

EHD蛋白家族包括3個區域：一個C端Eps同源結構域，該特征性結構具有正電荷靜電表面，能夠選擇性結合包含天冬酰胺-脯氨酸-苯丙氨酸（asn pro phe，NPF）基序的酸性殘基蛋白質[14]；一個是中央非保守的連接區和非常保守的N端結構域；一個是可以結合ATP并催化其水解的類似動力蛋白的G結構域[7]。EHD家族具有高度的同源性，而其中序列同源性和功能差異最大的是EHD2[15]。與EHD1、EHD3、EHD4的囊狀膜定位形成鮮明對比，EHD2定位于質膜的內葉上，是最保守的EHD家族成員。它通過其C末端的EH結構域和其N端結構域相互作用，參與細胞骨架、膜的構建和吞噬作用[16]。小鼠EHD2晶體結構表明，在G結構域附近的一個非結構柔性環中包一個含有兩個脯氨酸-苯丙氨酸基序KPFRKLNPF，該區域部分保守，通過與鄰近的EH結構域相互作用，將EHD2二聚體連接起來[16]。PF基序對于EHD2的定位和功能非常重要[17]，在EHD2的雙PF基序促進其穿梭至細胞核，可能作為轉錄抑制器而阻礙腫瘤細胞的轉錄[18]。

2 EHD2的生物學功能

對于EHD2 的早期研究主要集中在肌發生和肌肉修復中的作用。有研究[19]發現，在哺乳動物心臟中EHD 家族成員均高表達，在小鼠骨骼肌和腎臟免疫組化染色中顯示EHD2 特異性定位在血管組織系統[20]，并且在脂肪、肺、骨骼肌、脾中表達均有增加[21]。Ferlin蛋白家族成員包含多個C2結構，介導蛋白之間以及蛋白和膜之間的相互作用，被認為可以在修復位點促進囊泡的運輸和（或）融合，在肌發生和肌肉修復中起重要作用。而已有研究[22-23]證明，myferlin和Fer1L5 包含可以與EHD2 結合的NPF 基序,因此EHD2 與myoferlin 和Fer1L5 共定位于離散的質膜結構，是成肌細胞融合所必須的。在另一個使用激光損傷原代肌管的研究[24]中認為，EHD2作為肌修復的新的參與者，除了EHD2外，dysferlin和外周膜結合擔保A1也被募集到膜愈合部位。雖然dysferlin不具有典型的NPF 基序，但是它包含一個NPxF 序列，并推測其與EHD2有相互作用。另外，Fer1L5NPF基序的突變減少后并沒有減少與EHD2 的結合，這表明EHD2與ferlin蛋白的結合可能與其他相互作用模式有關[23]。這些研究提出了新的關于EHD2 促進膜聚合機制的問題。

定位在質膜微囊中的內源性EHD2，在細胞中具有多種功能，包括調節細胞信號、膽固醇穩態、內吞作用等[25-26]，其蛋白質組學分析首次確立了EHD2 可作為質膜微囊組成成分[27]。對從脂肪細胞中分離出來的微囊進行蛋白質組學分析，亦發現EHD2是微囊的成分[28-29]。多項研究[4,17]表明，內源性的EHD2和質膜微囊標志共定位，并且確認了EHD2在抑制質膜微囊動力方面的作用。當EHD2缺乏時，質膜微囊會變得更具活力，顯示出更強的動力，繁殖能力增強[4,17]。EHD2 調節內吞作用主要是水解與脂質相連的核苷酸，并將它們降解為小管，影響膜的重建[30]。

在各種細胞類型中，免疫染色均顯示含有EHD2的結構和肌動蛋白骨架有關。如，在損傷的肌肉纖維中，EHD2 與絲狀肌動蛋白在膜修復部位共定位[24]；在脂肪細胞中，EDH2 被發現存在于質膜下的環狀結構中，且與皮質肌動蛋白密切相關[21]；在成纖維COS-1細胞中，EHD2存在于富含肌動蛋白的膜褶皺中[21]，在絲狀偽足和微刺中EHD2均高表達[30]；在人成纖維細胞中，含有EHD2的質膜微囊沿著肌動蛋白排列[4]。EHD2可通過不同方式與肌動蛋白細胞骨架相聯系，如通過肌動蛋白結合蛋白1（fascin actinbundling protein 1，EHBP1）。EHBP1 含有可以和EHD2 結合的5 個近似于NPF 的基序[21]。EHD2 還可以作用于Ras 相關C3 肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）基因來調節肌動蛋白的重構[31]。EHD2 與絲氨酸/蘇氨酸激酶（Nek3）結合，可激活Vav 蛋白家族成員[32-33]。隨后Vav 蛋白反過來激活小RhoGTP酶，其中包括了Rac1。EHD2與Vav1 相關，過表達的EHD2 會導致Rac 活性降低，而Rac 蛋白是細胞骨架調節蛋白的關鍵蛋白，因此EHD2在細胞骨架蛋白中發揮著重要作用。

綜上，EHD2 定位于質膜微囊，在血管和肌肉細胞中，尤其是參與肌細胞的膜融合和再封閉中顯著表達；同時，它與肌動蛋白骨架形成密切相關，這些均提示EHD2是內吞運輸及循環的關鍵媒介[4]。

3 EHD2在腫瘤發生發展中的作用及其調控機制

內吞作用與肌動蛋白細胞骨架的功能關系密切。而肌動蛋白骨架在各種細胞過程中均起到重要作用，如細胞黏附、細胞形態的維持、細胞遷移、胞質分裂等。近年來人們注意到，如果干擾EHD2表達水平使其降低，那么會明顯影響細胞的內吞作用。EHD2不僅是在正常細胞過程起作用，而且在腫瘤發生過程中也具有潛在的作用。2006年，有研究[34]發現與對照組人類卵巢表面上皮相比，EHD2的表達在卵巢漿液性乳頭狀癌中下調了15 倍[34]。因此，在隨后的研究中EHD2 在腫瘤發生發展過程中的作用也受到越來越多的關注。

3.1 EHD2與細胞增殖

繼往研究[35]發現，在乳腺癌細胞中EHD2表達發生了缺失，而其表達的降低會促進乳腺癌細胞系的細胞增殖。EHD2 負性調控表皮生長因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）的內吞降解，使細胞增殖生長能力全面下降[36]。在人體食管癌組織標本中同樣發現EHD2 表達下降，并且在食管癌TE-1 細胞系中干擾EHD2后，細胞生長速度加快[10]。但是在甲狀腺乳頭狀癌中，EHD2的表達上調與細胞增殖能力呈正相關，并且通過與激活細胞增殖相關的MAPK/ERK信號通路促進腫瘤進展[11]。研究[38]還發現，在肝癌中，EHD2 的缺失明顯降低了巨胞飲作用，減少了缺氧細胞的增殖。巨胞飲是內吞的一種形式，由于腫瘤細胞急劇擴張及異常的血管微環境，腫瘤組織內部常得不到充分的營養，細胞通過巨胞飲攝取生物大分子，提高細胞的資源利用率，它被認為是癌癥中普遍現象[37]，但背后的調控機制尚不完全明確，該研究認為EHD2 可以通過介導巨胞飲作用來促進細胞的生長，并且是缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）的轉錄靶點[38]。EHD2在不同腫瘤中的表達差異被認為與腫瘤的異質性相關。

3.2 EHD2與促血管生成

在三陰乳腺癌細胞（triple negative breast cancer,TNBC）中，EHD2 的表達與IL-8 具有較為密切的關系。事實上，IL-8 有很強的促血管生成作用，在很多實體腫瘤中上調，如前列腺癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、肺癌等[39-41]。有數據[42]證明，IL-8可能通過促血管生成的機制介導乳腺癌的發生和進展，同時也是癌癥干細胞活動的重要調節因子。在TNBC 中發現，EHD2 的缺失會導致促血管生成的細胞因子IL-8 的表達水平升高，被認為是抑制IL-8途徑的潛在靶點[43]。

3.3 EHD2與細胞侵襲、轉移

EHD2 因其參與內吞循環過程被認為與腫瘤細胞侵襲和轉移的關系最為密切。在乳腺癌中，EHD2是乳腺上皮細胞極性維持的重要調節分子，FAK/PI-3K/Rac1/actin信號通路與控制細胞運動相關，FAK是一種細胞質蛋白的酪氨酸激酶，在細胞黏附于細胞外基質時被激活。FAK的磷酸化激活級聯激酶能夠促進細胞的運動[44]。在乳腺癌細胞中過表達EHD2會導致FAK 顯著降低，抑制Rac1 的表達，從而降低E-cadherin水平來阻遏EMT進程，影響乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力[8]。在神經膠質瘤中EHD2可以通過Snail 蛋白誘導發生EMT，低表達的EHD2 可以促進膠質瘤的轉移和侵襲。食管鱗狀細胞癌是一種高度侵襲性疾病，識別功能性轉移基因及其分子機制是熱點問題。在食管癌細胞中當EHD2表達下調后，Ecadherin 表達下降，細胞遷移能力增加[10]?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族的主要功能是降解細胞外基質，和腫瘤侵襲和轉移密切相關。MMP2 和MMP9 是家族中兩個非常重要的分子，它們的活性賦予了腫瘤細胞遷移和侵襲的特征[45]。在腎透明細胞癌中發現當EHD2 過表達后會上調MMP2、MMP9 的表達，從而促進細胞的侵襲和轉移[12]，提示EHD2在不同類型腫瘤中可能表現出不同的生物學行為。

3.4 EHD2與細胞凋亡

Bcl2和Bcl2-associated X蛋白（BAX）是用來評價細胞凋亡的標志。在腎透明細胞癌組織中，當EHD2過表達后會促進Bcl2，而抑制BAX的表達，阻礙細胞凋亡，促進腫瘤的發生發展[12]。與在其他腫瘤中表達有所差異，EHD2的表達水平較正常組織高明顯升高，降低EHD2的表達促進細胞凋亡而阻礙腎透明細胞癌的進展。但是研究中僅使用40例病例，因此認為樣還需來進一步驗證其實驗結果[12]。還有研究[10]發現用順鉑處理轉染siEHD2的食管鱗癌細胞，結果發現細胞對順鉑引起的凋亡產生抵抗。目前EHD2介導的細胞凋亡的具體機制尚不完全明確，還需進一步的研究。

3.5 EHD2與相關基因的調控

骨肉瘤是一種常見的影響骨骼生長的原發性惡性腫瘤，多發生于25 歲以下的患者[46]。雖然先進的治療方法顯著提高了患者的保肢率和長期生存率，但是復發和轉移風險仍舊很高[47]。有研究[13]鑒定出EHD2 是與腫瘤相關的非編碼RNAMiR-197-3p 的下游靶基因，新型的IncRNA TUSC8在骨肉瘤組織和細胞系中表達明顯下降，增強TUSC8 的表達會抑制細胞的增殖、遷移和侵襲，從而促進細胞的凋亡。TUSC8 和MiR-197-3p 相互作用靶向EHD2 的表達，從而抑制骨肉瘤的進展。該研究是在體外細胞實驗完成的，在未來還需進一步在體內實驗驗證這一研究結果。在乳腺癌中，EHD2是與癌細胞增殖相關的RCN1/PIGX/RCN2復合物的一個靶基因，研究[48]發現該復合物能夠下調EHD2 的表達，并與EMT 的重要標志E-cadherin的表達水平呈正相關。在結腸癌中，轉錄因子上皮細胞特異性Ets 蛋白3（epitheliumspecific Ets protein 3，Ese-3）通過下調EHD2 和轉導INPP4B促進細胞增殖[49]。

4 EHD2在腫瘤防治中的意義

在食管鱗癌中，EHD2的表達和患者病理分級呈負相關，與腫瘤淋巴結轉移密切相關，EHD2表達越低，淋巴結轉移能力越強，提示EHD2低表達是食管鱗癌高惡性度的標志物[10]；在乳腺癌中，檢測到EHD2的表達明顯減少，其表達水平和患者病理分級呈負相關，與總體生存率降低密切相關，是預后不良的標志物[8]；在惡性漿液性卵巢癌中，EHD2呈低表達[34]，并可能是神經膠質瘤缺失染色體1.6Mb19區一個可能的抑癌基因[50]；在結腸癌組織中，EHD2表達下調提示患者預后不佳[51]；但是，在TCGA數據庫中，EHD2 mRNA的表達與更具侵襲性的變異、甲狀腺外延、pT與pN1分期晚期、高風險復發呈正相關[54]；在甲狀腺乳頭狀癌浸潤前出現的細胞極性喪失而出現的EMT 現象被認為和EHD2的表達升高密切相關[52-53]；在腎透明細胞癌中，抑制EHD2 會阻遏細胞增殖、侵襲和遷移，促進細胞凋亡，被認為有可能成為臨床治療的靶點[12]。綜上，EHD2的表達情況在不同腫瘤中雖不盡相同，但有望成為診斷及預測預后的一種指標，對腫瘤患者的臨床治療及預后評估具有重要意義。

5 結語

隨著對EHD2研究的深入，其在生物體發育及惡性腫瘤發生發展中作用機制不斷明了。一方面，EHD2在不同種類腫瘤中表達不同，參與調控腫瘤的生長、轉移、侵襲。另一方面，EHD2與腫瘤的臨床分期分級和預后密切相關，在腫瘤的診斷和預測評估中扮演重要角色。因此，探索并闡明EHD2的作用機制，不僅有助于尋找新的腫瘤生物學特征的標志物，也可提高腫瘤的早期診斷、聯合治療、預后評估和減少復發提供思路。但EHD2 在腫瘤中的機制缺乏多中心大樣本的研究數據，尚需進一步研究闡明EHD2的上下游基因及其作用通路，為腫瘤的靶向治療提供更有價值的依據。