拉曼技術在泌尿系統腫瘤檢測中的應用

郝 哲，岳蜀華△，周利群

[1. 北京航空航天大學生物與醫學工程學院，北京市生物醫學工程高精尖創新中心，生物力學與力生物學教育部重點實驗室，醫用光子學研究所，北京 100083； 2. 北京大學第一醫院泌尿外科，北京大學泌尿外科研究所，國家泌尿、男性生殖系腫瘤研究中心，泌尿生殖系疾病(男)分子診治北京市重點實驗室，北京 100034]

目前主流的泌尿系統腫瘤檢測手段存在各自的不足，應用于腫瘤診斷和復查具有一定的局限性。比如，組織病理學檢查是泌尿系統惡性腫瘤診斷的“金標準”[1]，但其有創、操作繁瑣、所需診斷時間過長，多應用于術后確診和預后評估，而術中快速冰凍病理難以區分腫瘤亞型[2]。影像學檢查盡管具有無創、快速的優勢，但較難明確病變性質，并且對早期腫瘤診斷靈敏度低[3]。因此，臨床亟需快速、精準的泌尿系統惡性腫瘤檢測方法。

分子光譜已在許多領域得到應用，通過增強成像對比度、分辨率和分子特異性等性能使其成為生物醫學領域研究的有力手段。過去30年里，拉曼光譜技術已廣泛應用于生物化學分析。拉曼光譜是分子水平上高度特異性的指紋散射信號，可提供物質的分子成分和結構信息[4]，能夠檢測出腫瘤細胞中基本成分(如蛋白質、核酸、脂質和碳水化合物)結構的變化[5-6]。拉曼光譜技術作為一種快速且無創的分析方法，無需任何樣品預處理和修飾，且不會受到組織、血液、尿液等樣品中水分的干擾，因此，非常適合于體內或離體癌細胞和組織的檢測[7-9]。本文將討論拉曼光譜技術在三種最常見泌尿系統腫瘤(前列腺癌、膀胱癌、腎細胞癌)中的應用現狀和發展趨勢。

1 拉曼技術概述

拉曼散射是一種基于光與分子鍵振動模式的相互作用的散射現象，其產生的散射光子的頻率取決于被照射分子化學鍵的振動和旋轉特性[10]，散射光子與入射光子頻率之差稱為拉曼位移。

拉曼光譜技術是基于拉曼散射效應的分子結構分析技術，拉曼信號源自分子化學鍵的振動，所以拉曼光譜的特征能帶位置、強度和線寬提供了分子振動和旋轉的信息，可以表征分子中不同的化學鍵或官能團[11]。因此，拉曼光譜可用于識別分子的“指紋”信息，長期以來廣泛用于分析細胞和組織中的化學成分，并可以無需任何標記就非侵入性地檢測到發生疾病轉化的細胞或組織中分子特征的改變[12]，具有作為癌癥診斷新型工具的潛力。然而，基于自發拉曼散射光譜的成像耗時很長，難以實現生物活體動態分子成像。

為了提高拉曼散射信號水平，相干反斯托克斯拉曼散射 (coherent anti-Stokes Raman scattering，CARS)和受激拉曼散射(stimulated Raman scattering, SRS)顯微鏡被相繼開發。在CARS中，需要一束泵浦(頻率為ωP)和一束斯托克斯(頻率為ωS)激光來激發樣品，當入射光的ωP-ωS與所測量的分子化學鍵振動頻率Ω相等時，會將樣品激發出一束新的頻率為2ωP-ωS的光，即CARS[13]。只有當ωP-ωS靠近所探測物質的拉曼特征峰時CARS信號才會急劇增強，這使得CARS具有良好的化學特異性[14-15]。由于CARS現象只有在兩束光同時到達樣品同一位置時才會發生，所以其具有三維成像能力[15]。然而，CARS是一個非線性四波混頻過程，其信號包含與樣品拉曼位移無關的非共振部分，致使CARS信號相對拉曼光譜發生移動，導致CARS成像中的激發波長選擇以及物質識別十分困難，并且其信號中非共振背景很可能湮沒了一些指紋區微弱信號，最終導致結果不準確。

SRS 也需泵浦光(頻率為ωP)和斯托克斯(頻率為ωS)兩束激光激發，但在成像原理上SRS信號沒有非共振背景的干擾，這使得 SRS 顯微成像成為一種高靈敏和可定量的生化成像方法[16]。SRS過程中入射光的光子能量與待測物分子(化學鍵振動頻率為Ω)之間發生交換，泵浦光束強度減弱(受激拉曼損失)，斯托克斯光束強度增加(受激拉曼增益)，最后通過探測受激拉曼損失或受激拉曼增益[17]得到分子的SRS信號。其中，兩束入射光只有在嚴格滿足ωP-ωS=Ω時才能夠發生SRS現象，該過程中不會涉及CARS中的非共振背景信號，因而SRS所攜帶的光譜信息與分子自發拉曼的光譜信息相同，信號強度與分子濃度線性相關[18]，也就是說SRS可以對物質分子含量進行定量分析。SRS信號強度比自發拉曼增強了6個數量級左右，信號采集時間顯著縮短，成像速度更快，可達視頻幀率[19]。

此外，納米技術的快速發展推動了表面增強拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering，SERS)的發展[20-21]。SERS 使用激光對納米結構或粗糙的金屬表面進行激發[20]，通過對這些納米結構或金屬結構的激發來驅動表面電荷以產生局部等離子體場，即增強的電場。當分子靠近表面并因此增強電場時，可以觀察到拉曼信號的大幅增強，導致拉曼信號比正常拉曼散射大8～14個數量級[21]，這使得無需任何熒光標記就可以檢測低濃度樣品。

2 拉曼技術在膀胱癌檢測中的應用

目前膀胱癌診斷和篩查主要依靠膀胱鏡檢查和尿液細胞學檢查[22]，因膀胱癌復發率高(50%～70%)[23]，患者確診后必須定期復查。膀胱鏡對微小腫瘤的診斷準確性較低，尤其是膀胱原位癌，其漏檢率高達50%[24-25]，且膀胱鏡具有侵入性，相比較而言，尿液細胞學檢查具有非侵入的優勢，但又易受病理醫師主觀因素的影響，且對低級別膀胱癌診斷的靈敏度只有16%[26]。

基于此，研究者們正在推動基于尿液樣本中的基因表達差異或蛋白質生物標志物的膀胱癌診斷和監測系統[27]。但由于樣品存放時間和處理條件的變化，使得尿液樣本中蛋白質、DNA 和 RNA 發生降解，導致尿液中此類生物標志物的靈敏度和特異性不夠穩定。目前美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準用于診斷膀胱癌的尿液生物標志物檢測試劑盒靈敏度和特異性均較低，比如：膀胱腫瘤抗原BTA-TRAK 試劑盒分別為 66%和75%[28]，核基質蛋白22 試劑盒分別為55%和88%[29]，免疫細胞/Cyt+測定試劑盒分別為73%和66%[30]，UroVysion 熒光原位雜交檢測試劑盒分別63%和87%[28]。此外，較高的測試成本也限制了這些試劑盒在臨床中的應用[27-28]。

2002年Stone 等[31]首次將拉曼光譜應用于膀胱癌檢測，驗證了拉曼光譜在上皮癌和癌前病變分類中應用的可能性。該研究對離體狀態下的12對膀胱癌和癌旁組織進行無標記拉曼光譜采集，在20 s內得到了一條拉曼光譜數據，對比分析得出拉曼光譜區分兩種組織的靈敏度和特異性分別為89.6%和97.2%。雖然該研究的樣本量較少，但也初步提示利用拉曼光譜技術探測生物分子信息從而識別膀胱癌具有可行性，為后期應用拉曼光譜檢測膀胱腫瘤的研究開拓了思路。為了區分膀胱鏡下難以辨別的膀胱炎癥與早期膀胱腫瘤組織，Crow等[32]利用拉曼光譜技術在體外對人源膀胱上皮、膀胱炎、膀胱尿路上皮癌組織進行識別，預測膀胱上皮組織病理類型，得出各組的靈敏度和特異性都大于90%。此外，他們還將拉曼光譜技術應用于低級別膀胱癌(T1和Ta)的識別，同樣得到了理想的結果，預測的靈敏度和特異度都達到了96%[32]。為了進一步提升拉曼光譜技術對膀胱癌分類的準確性，de Jong 等[33]將拉曼光譜與主成分分析、線性判別分析等統計分析方法相結合，分析膀胱癌組織的病理分級，建立了一套基于拉曼光譜的膀胱癌組織病理類型的檢測方案，分類準確率為93%，靈敏度為94%，特異性為92%。但上述研究均基于體外組織切片，并未進行在體臨床驗證。2010年Draga等[34]完成了第一項在體拉曼光譜研究，通過膀胱癌與正常膀胱上皮組織差異光譜比對，發現膀胱癌的特定氨基酸峰強度的升高(可能與 DNA 峰高增加有關)，最終得出拉曼光譜鑒別正常膀胱上皮和膀胱癌組織的靈敏度可達到85%，特異性為79%。提示在經尿道切除膀胱腫瘤的過程中，可以將拉曼光譜應用于膀胱鏡檢查進行實時診斷。但受探頭的限制，拉曼光譜的探測光斑面積只有平方毫米級別，因而篩選整個膀胱非常耗時，目前只能作為膀胱鏡的輔助檢測手段，未來可結合其他廣視野的內鏡檢測手段來提高拉曼光譜的檢測能力。

針對目前傳統細胞學檢測靈敏度較低的問題，Shapiro等[11]結合膀胱癌組織的拉曼光譜，檢測膀胱癌患者尿液中脫落細胞平均光譜，建立了基于尿脫落細胞的膀胱癌診斷模型，靈敏度為92%(對于高級腫瘤為100%)，特異性為91%，陽性預測值為94%，陰性預測值為88%，此外，該研究還實現了基于拉曼光譜的二維成像技術。為了進一步明確脫落細胞的種類，Yosef等[9]對不同類型尿液脫落細胞進行拉曼光譜鑒定，發現拉曼光譜可以在細胞水平上提供足夠的生物學信息，能夠以100%的準確率區分正常和癌變的尿路上皮細胞。為了提高拉曼信號強度，以利于拉曼光譜檢測應用于臨床，更多的研究致力于使用SERS技術來實現對膀胱癌的檢測與診斷。2019年Zhang等[35]的研究發現，SERS技術采集尿液標本的光譜信號強度是普通拉曼光譜信號的107倍，使光譜信號更容易被探測，并能在10 min內得到檢測報告，其檢測靈敏度高達91.7%，特異性高達100%。為了驗證SERS技術對低級別膀胱腫瘤的檢測效果， Hu等[36]利用SERS檢測膀胱癌患者和正常人尿沉渣平均光譜，得出SERS技術對低級別腫瘤總的診斷靈敏度和特異性分別為97.53%和90.80%，對高級別腫瘤分別為100%和98.85%。

由此可見，拉曼光譜顯著提高了診斷的靈敏度。相比于其他幾種FDA批準的基于尿液生物標志物的膀胱癌檢測方法，拉曼光譜無需染色處理，大大縮短了檢測時間，提高了檢測效率。除了拉曼光譜檢測外，未來可發展基于拉曼光譜二維成像技術的單細胞水平檢測，以獲得細胞水平的二維圖像。盡管基于拉曼光譜的二維成像受限于成像的速度而無法滿足臨床檢測需求，但可基于拉曼二維圖像進行病理偽彩處理，以貼近病理染色圖像形式直觀地呈現給醫師。

3 拉曼技術在腎細胞癌檢測中的應用

根據歐洲泌尿外科協會(European Association of Urology，EAU)指南，應將保留腎功能的保腎手術作為腎細胞癌早期階段(T1a及部分T1b)治療中的首選術式，并對晚期腎細胞癌(T3 ～ T4)進行根治性腎切除術[37]。因此，早期診斷和篩查腎細胞癌以及根據腎細胞癌的分級相應地調整手術計劃對患者大有裨益。目前臨床上使用的腎腫塊活組織檢查得到的腎細胞癌病理特征準確性低至79%[38]，并且其在病理分級中的作用也存在爭議[39]；傳統組織病理作為確定腎細胞癌亞型的金標準，繁瑣耗時[1]，難以滿足術中實時指導手術的需求。另外，腎周脂肪浸潤對腎細胞癌患者手術方案的選擇也具有重要影響，目前的影像學檢查，如磁共振成像和計算機斷層成像都難以識別腎周脂肪浸潤[40]。

2009年Wills等[41]驗證了拉曼光譜技術在區分正常腎臟組織和腎細胞癌組織中的可行性(診斷準確率為96%)， 隨后的研究相繼證實了拉曼光譜技術在腎細胞癌組織識別方面的優勢，其平均診斷準確率為96%(93%～100%)[42-44]。此外，拉曼光譜的時效性也使其具備應用于術中切緣檢測的潛力。為了滿足術中定位切緣的需求，Bensalah等[10]將拉曼光譜技術與光學纖維內鏡進行結合，對34對手術離體新鮮腎細胞癌組織和正常組織進行拉曼光譜檢測，得出的組織分類準確率為93%，靈敏度為96%，特異性為 87%，但因該研究納入的樣本量有限而使其可信度受到一定限制；此外，該研究還對良性和惡性腎腫瘤之間拉曼光譜差異進行了對比，但由于僅有2例良性腫瘤樣本，可靠性還有待進一步探索。為了研究良性和惡性腎腫瘤之間拉曼光譜的差異性， Couapel等[42]對53 例惡性腫瘤和 7 例良性腫瘤分別進行了拉曼光譜采集，得出其對組織分類的準確性為96%，識別直徑<4 cm腎腫瘤的準確率為93%。上述兩項研究均提示拉曼光譜可用于檢測腎細胞癌術中切緣，但兩者均為離體組織研究，樣本量較少，且未能考慮血紅蛋白對光譜信號的影響(血紅蛋白的拉曼光譜信號強度較高[9])，拉曼光譜應用于術中切緣檢測仍存在瓶頸。

近年，研究者們將目光轉向腎細胞癌診斷，希望通過拉曼光譜技術提高腎腫塊活組織檢查的準確性。2015年Mert等[44]利用SERS技術提高光譜信號以增強檢測的穩定性，采集40例腎臟正常組織和40例腎細胞癌活檢組織標本(T1期28例，T2～T3期12例)共800個SERS光譜，并結合主成分分析與線性判別分析對光譜進行探究，得出腎細胞癌晚期(T2～T3)、早期(T1)與正常組織分類的靈敏度分別為93%和100%，特異性分別為98%和86%，準確率分別為91%和90%，表明SERS是一種識別腎細胞癌不同分期的潛在技術手段。為了探究拉曼光譜技術對腎細胞癌亞型分類的準確性，He等[7]利用拉曼光譜對腎透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、腎上腺嗜鉻細胞瘤組織進行識別，判別準確性達到89.35%，可以為精準治療提供指導。此外，該研究還進一步利用拉曼光譜結合支持向量機(support vector machine，SVM)模型，通過分子水平上高度特異性的指紋區域識別腎癌和腎周脂肪，準確率達到92.5%，靈敏度和特異性分別為95.8%和88.8%，說明其可用于識別腎周脂肪浸潤，指導腎腫瘤切除策略。

4 拉曼技術在前列腺癌檢測中的應用

前列腺癌診斷的金標準仍依賴于經直腸超聲引導下穿刺活檢，但其準確率只有60%左右，且重復活檢陽性率達28%[45]。此外，廣泛用于前列腺篩查和診斷的生物標志物是前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen，PSA)， 但PSA水平升高并非前列腺癌所特有，良性前列腺增生和前列腺炎患者也常見PSA 水平升高[46]。因此，迫切需要生物標志物來提高前列腺癌診斷的特異性和靈敏度。前列腺癌的早期和準確診斷對于降低不良反應和死亡率起著至關重要的作用。

2003年Crow等[47]分析了14例良性前列腺增生和13例前列腺癌冰凍組織共450個拉曼光譜數據，發現兩種組織細胞內的核酸和糖原濃度存在顯著差異，該研究進一步分析了不同Gleason分級(<7，=7，>7)的前列腺癌組織拉曼光譜數據，建立了準確率為89%的基于拉曼光譜的前列腺癌分類模型，表明拉曼光譜技術可用于體外區分良性前列腺增生和不同Gleason分級的前列腺癌。但該研究只對核酸和糖原含量的差異性做了分析，準確率還有待提高，為了對分子差異類型有更深入的了解，還需從前列腺組織的拉曼光譜中挖掘更多的生化信息。隨后，Crow等[48]又針對4種前列腺癌細胞系(LNCap、MDA-PCa-2b、DU145、PC3)進行拉曼光譜分析，發現各細胞系間DNA、蛋白質、脂質、糖原濃度均有差異，據此建立的分類算法的總體靈敏度為98%，特異性為99%，進一步證明了拉曼光譜技術具有區分不同侵襲性前列腺癌的能力，可在臨床實踐中用于前列腺癌的診斷和分級。

以上研究都是基于單純光譜技術，為了對分子在樣本中的位置進行可視化，Tollefson等[49]使用基于拉曼光譜的二維成像觀察到轉移和未發生轉移的前列腺癌患者組織之間的拉曼光譜存在顯著差異，表明有望通過該技術識別有腫瘤進展風險的患者。但基于拉曼光譜的二維成像的速度較慢，在臨床應用時會受到限制。隨著快速相干拉曼成像技術的發展，2014年Yue等[18]通過SRS顯微成像和拉曼光譜技術，分析了前列腺癌細胞中單個脂滴成分，發現了前列腺癌組織中存在異常的膽固醇酯積累，表明膽固醇酯可作為侵襲性前列腺癌的診斷標志物，但此方案仍需要進一步臨床驗證。

此外，為了使檢測方式更易于患者接受，拉曼技術的研究者將目光轉向了前列腺癌的微創或無創檢測。Li等[50]對93例前列腺癌患者和68位健康人的血清SERS數據進行SVM分析，獲得了98.1%的分類準確性，初步證明了使用無標記血清 SERS分析技術結合 SVM 診斷算法在無創前列腺癌篩查中的巨大潛力。Chen等[51]使用SERS技術觀察到了低風險和高風險前列腺癌拉曼光譜的區別，檢測的準確率為92.3%，敏感性為89.5%，特異性為95%，表明SERS診斷方法可用于提高 PSA異?；颊叩幕顧z陽性率，但檢測靈敏度和準確率還有待提高。2019年Gao等[52]開發了一種新型基于SERS的微流控芯片，該芯片對PSA的檢出限為0.1 μg/L，且可在5 min內完成診斷，在前列腺癌早期篩查中的應用前景廣闊。此外，還可在前列腺癌的早期篩查中應用SERS技術檢測血漿[53]、尿液(準確率為92%)[54]或者精液(總體診斷準確率為95%，靈敏度為100%，特異性為89%)[55]，但均有待進一步臨床驗證。

綜上，拉曼散射技術的優勢在于高靈敏度和特異性，可以快速準確地區分癌或癌前病變組織與正常組織，憑借對生物分子進行無標記和高靈敏度原位分析的能力，拉曼散射技術為腫瘤診斷提供了強大的工具。從拉曼光譜的發展到納米粒子增強和非線性拉曼技術的開發，拉曼光譜技術在科學研究和臨床應用中都顯示出良好前景，儀器、方法和數據分析的進步使拉曼顯微成像從體外細胞分析到體內臨床成像的各種應用均成為可能。拉曼光譜、SERS和非線性光譜技術的發展取得了令人矚目的進展。針對泌尿系統惡性腫瘤現有檢測方法的靈敏度和特異性不足的問題，基于拉曼散射的技術結合人工智能分析有望為臨床提供更精準的早期診斷、術中檢測和病理分級依據。目前，使用拉曼光譜進行腫瘤診斷的挑戰仍然是如何為不同組織找到特異性的分子標記，高光譜SRS顯微鏡可以定量繪制不同類型的分子圖像，有望成為識別腫瘤生物標志物的新方法。

然而，目前基于拉曼散射技術的檢測手段還沒有應用于臨床，這是因為非線性光學顯微成像的激光光源存在價格昂貴、占用空間大以及可靠性不高的問題，需要專業工程師進行維護，這使其在臨床轉化方面存在技術挑戰，因此，將來需集中解決設備尺寸、可靠性、易操作性和檢測成本效益等方面的問題。此外，還應在以下幾個方面開展大量的研究以推進基于拉曼散射技術在臨床應用的可能性：首先是使用手持快速拉曼成像技術進行原位分子診斷，例如手持拉曼光譜或高光譜SRS顯微鏡；其次是進行多模態的成像和光譜系統開發，整合每種分析方法的優點，從而提供更精準的癌癥診斷工具。