抗菌止血水凝膠醫用敷料的制備及其性能研究

馬 莉，仇威王，吳德群，2

(1.東華大學 紡織學院，上海 201620；2.東華大學 紡織面料技術教育部重點實驗室，上海 201620)

0 引言

醫用傷口敷料旨在提供一個合適的環境促進傷口愈合，并預防細菌感染。因此，傳統敷料如紗布或者棉團已逐步被新型醫用敷料占據市場。目前，水膠體、支架和水凝膠等促濕材料比傳統干燥醫用材料更受歡迎[1]。而水凝膠作為新興材料，本身質地柔軟，具有極強的保水性和不黏連性，水凝膠材料具有多孔結構，可吸附大量的水，通過其水分交換活動幫助促進傷口愈合，并可提供相對冷卻的環境，舒緩傷口疼痛，在傷口和敷料之間形成最佳環境[2]。

葡聚糖是一種高水溶性天然多糖，由細菌分泌。葡聚糖制備的水凝膠具有優異的生物相容性和生物降解性等特性[3]。通過修飾，葡聚糖可以功能化和交聯，并應用于物質分離、藥物輸送和組織工程領域[4]。長鏈烷基季銨鹽類抗菌劑是一種在織物品類中應用較廣的抗菌劑。由于季銨鹽帶正電，細胞膜帶負電，季銨鹽與細菌細胞膜結合后細胞膜破裂，從而達到抗菌目的[5]，因此長鏈烷基季銨鹽的良好的抗菌性能及抗菌持久性擁有廣泛的市場。

本文以十六烷基二甲基乙基溴化銨和γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(KH-570)接枝棉織物制得改性抗菌棉織物，經過改性的葡聚糖水凝膠單體、抗菌胍鹽、凝血酶、混合溶液浸泡在改性抗菌織物中，通過紫外光原位交聯方式形成敷料，并研究了其抗菌性、止血性、溶脹性等一系列性能。該方法制備得到織物增強的多糖類水凝膠基敷料具有優良的吸液性、抗菌性和止血性，同時具有良好的機械性能及柔軟性，能加快傷口愈合。

1 實驗部分

1.1 原料

棉織物(平紋組織，克重為156 g/m2)，葡聚糖(Mw＝70000)購買于百靈威科技公司，甲基丙烯酸酐(MA)購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，N，N’-二甲基甲酰胺、二氯甲烷購買于上海凌峰公司，氯化鋰、三乙胺、異丙醇、無水乙醇均購買于國藥集團化學試劑有限公司，十六烷基二甲基乙基溴化銨、凝血酶購買于上海源葉生物科技有限公司，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌購買于南京便診生物科技有限公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購買于上海酶聯生物，瓊脂購買于中國惠興生化，γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(KH-570)、鹽酸胍購買于上海皓鴻生物醫藥科技有限公司，2-羥基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮(I2959)、1，6-己二胺購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

MS7-H550-S磁力攪拌器(上海亞榮)，Nicolet 6700型傅里葉紅外光譜儀(美國賽默飛世爾)，Avance400型核磁共振氫譜儀(瑞士布魯克)，FSTRO-10超純水機(上海富詩特)，AL204電子天平(梅特勒-托利多集團)，ML-3500紫外線燈(上海峰志)，DZF-6050真空干燥箱(上海精宏)，S-4800型場發射掃描電子顯微鏡(日本日立)，LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安)，HWS-250HL型恒溫培養空氣搖床(上海賀德)，SPX-80B-II型生化培養箱(上海賀德)，DKZ系列電熱恒溫振蕩水槽(上海一恒科技)，HD-650型超凈臺(蘇州凈化)，ALPHAL-2冷凍干燥機(德國克萊斯特)，YG(B)026G型電子織物強力機(溫州大榮紡織儀器)。

1.3 持久抗菌棉織物的制備

1.3.1 改性棉織物得制備

先對棉織物進行了抗菌和不飽和雙鍵改性，然后將水凝膠在棉織物表面原位聚合，通過化學交聯和物理穿插交聯作用與棉織物復合，制備織物增強多功能水凝膠敷料，以實現優良的抗菌和止血性能。

首先，稱取充分干燥后的純棉織物；將不同質量的十六烷基季銨鹽、γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(KH-570)溶解于20 mL乙醇水溶液里(無水乙醇∶水＝1∶1)，加入稀鹽酸調節溶液pH在5～6之間。將純棉織物放入上述溶液中，室溫下(25℃)反應12 h。反應完成后，超聲清洗棉織物并水洗，充分除去未反應的單體，制備改性棉織物。改性棉織物的投料比如表1所示:

表1 改性棉織物的投料比

1.3.2 M-PHMG單體的合成

參考文獻[6]，聚六亞甲基胍鹽酸鹽(PHMG)的制備方法為:在容器中加入14.5 g 1，6-己二胺與12 g鹽酸胍，在N2保護下溫度為120℃的條件中反應2 h，同時除去產生的NH3，接著在溫度為180℃條件下反應6 h，然后將產物后放置于100℃的真空烘箱中烘干6 h，制備PHMG；改性聚六亞甲基胍鹽酸鹽(M-PHMG)的制備方法為:用量筒稱量10 mL DMSO倒入容器中，并稱取1.25 g PHMG與0.5 g甲基丙烯酸酐(MA)放入容器中，室溫條件下在磁力攪拌臺上攪拌均勻后加入0.5 g三乙胺，并在黑暗冰浴條件下反應24 h，最后使用二氯甲烷將產物萃取3～5次后置于真空烘箱中室溫條件下烘干，得到M-PHMG，化學反應式如圖1所示:

圖1 M-PHMG的合成

1.3.3 Dex-MA單體的合成

在90℃高溫條件下，將4 g葡聚糖溶解于100 mL氯化鋰和N，N’-二甲基甲酰胺的混合溶液中(氯化鋰含量為10 wt%)，通氮氣溶解。待葡聚糖完全溶解后，溶液冷卻至70℃，將0.36 g三乙胺催化劑加入到葡聚糖溶液中，磁力攪拌10 min，再加入5.5 g甲基丙烯酸酐在氮氣的保護下反應10 h。反應混合物在冷異丙醇中沉淀析出，用異丙醇洗滌三到五次，沉淀、過濾、干燥，得到產物帶有雙鍵的葡聚糖(Dex-MA)單體。反應原理如圖2所示:

圖2 Dex-MA單體的合成

1.3.4 抗菌止血水凝膠以及織物增強水凝膠敷料的制備

將經過改性的葡聚糖單體溶于去離子水中，制備20 w/v%的改性的葡聚糖單體溶液，加入光引發劑(I2959)、不同質量的改性抗菌劑和凝血酶，通過紫外光原位交聯方式形成水凝膠。具體投料比及紫外光照時間如下頁表2所示。

水凝膠復合棉織物敷料制備方法按照表2相同配比在紫外光照射之前將充分干燥的改性棉織物裁剪成一定的大小后平鋪，將改性后的抗菌織物浸泡在上述混合溶液中，使得每平方厘米織物沉積約0.1 mL的水凝膠。然后轉移至紫外燈下，紫外光照10 min，引發自由基聚合，得到水凝膠復合棉織物。

表2 水凝膠的投料比

1.4 實驗測試與性能分析

1.4.1 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)

為確認單體結構，將干燥后的樣品放置于Nicolet 6700型傅里葉紅外光譜儀的探頭下測試，并記錄范圍為500 cm-1～4000 cm-1的光譜。

1.4.2 核磁共振氫譜(1H NMR)

將5 mg～8 mg樣品溶解于裝有氘代水的核磁管中，使用AVANCE400型核磁共振波譜儀進行測試，測試后確定單體中H的歸屬。

1.4.3 場發射掃描電子顯微鏡(SEM)

樣品經過冷凍干燥后粘在附有有導電膠的樣品臺上，經噴金制樣后采用S-4800型場發射掃描電子顯微鏡對樣品表面形態進行測試，觀察其表面形態。

1.4.4 溶脹性測試

秤取0.75 g經過凍干后的水凝膠樣品放于PBS溶液中，此時樣品質量記為m0，每隔一段時間取出，用濾紙將水凝膠表面的水擦干凈，立即稱取試樣質量，將此質量記為m，按照以下公式(1)計算每個試樣的溶脹倍數[7]:

1.4.5 定性抗菌性能實驗

為探究樣品是否具有抗菌性能，進行定性抗菌實驗。首先將瓊脂以及相關器皿滅菌處理，再在無菌培養皿中加入10 mL～15 mL滅過菌的瓊脂培養基，然后將培養好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液稀釋至1×104CFU/mL，取0.5 mL稀釋后的菌液涂附在冷卻凝固了的瓊脂表面中，最后在涂覆了細菌的瓊脂板中間放置直徑為2.5 cm的織物樣品，然后將其置于生化培養箱中培養24 h后取出揭開織物樣品，觀察與織物接觸面的細菌繁殖狀態。

1.4.6 定量抗菌性能實驗

以GB/T 20944.3-2008為標準，將水凝膠敷料進行定量抗菌實驗。在培養24 h后，將對照樣錐形瓶內的活菌濃度記為Wt，將樣品錐形瓶內的活菌濃度記為Qt[8]，計算試樣的抑菌性(Y)公式如下(2):

1.4.7 止血性能測試

將40只ICR級6～8周小鼠(上海杰思捷實驗動物有限公司提供)隨機均分成4組，每組10只，雌雄各半。將所用敷料分為4組，第1組為改性織物CCT-4復合gel-6水凝膠敷料組，記為CCT-4-gel-6；第2組為改性織物CCT-4復合gel-7水凝膠敷料組，記為CCT-4-gel-7；第3組為改性織物CCT-4復合gel-8水凝膠敷料組，記為CCT-4-gel-8；第4組為改性織物CCT-4復合gel-9水凝膠敷料組，記為CCT-4-gel-9。實驗中將小鼠用固定器固定，然后剪斷距尾部3 cm左右位置的小鼠尾巴，待有血液流出后，分別將1～4組改性織物復合水凝膠敷料涂敷于小鼠斷尾截面處，每10 s記錄一次，直至不再有血液流出時記錄完全止血時間。

2 結果與討論

2.1 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)

Dex-MA的紅外光譜結果如下頁圖3所示，在1718 cm-1處有一個(C＝O)的紅外波段，在1657 cm-1(C＝C)和817 cm-1(C＝C-H)處的紅外光譜帶證實了Dex-MA中存在垂鏈乙烯基，證明了Dex-MA的成功合成。

圖3 Dex-MA的紅外光譜圖

分析傅里葉變換紅外光譜來確認PHMG的合成情況，如下頁圖4所示。位于3100 cm-1～3300 cm-1附近范圍為(-N-H)的伸縮振動峰；位于2800 cm-1～2900 cm-1范圍的峰為雙甲基中(-C-H)的對稱和反對稱伸縮振動峰；位于1623 cm-1范圍的峰為鹽酸胍以及PHMG上(-C＝N)的伸縮振動峰，說明鹽酸胍成功與1，6-己二胺發生了反應，生成PHMG。

圖4 PHMG的紅外光譜圖

分析傅里葉變換紅外光譜來確認M-PHMG的合成情況，如圖5所示。位于1622 cm-1處的峰為PHMG以及M-PHMG上(-C＝N)的伸縮振動峰，沒有明顯觀察到(-C＝C)的峰，推測是被1622 cm-1的峰所覆蓋。

圖5 M-PHMG的紅外光譜圖

2.2 核磁共振氫譜(1H NMR)

通過分析核磁共振氫譜(1H NMR)確認Dex-MA上各個H原子的歸屬，如圖6所示，DEX-MA中乙烯基的存在進一步被1H NMR光譜證實。在雙鍵區域有兩個明顯的a峰(5.71 ppm)和b峰和(6.11 ppm)，對應于雙鍵附近的兩個氫原子(-C＝CH2)，1.80 ppm位置處的c峰為甲基丙烯酸酯基團中甲基取代物(-CH3)上的氫。

圖6 Dex-MA單體的1H NMR

通過分析核磁共振氫譜(1H NMR)確認MPHMG上各個H原子的歸屬，如圖7所示。峰值在5.5 ppm～5.7 ppm處的a，b峰為雙鍵(-C＝CH2)上兩個氫原子，峰值位于1.75 ppm處的c峰為甲基取代物(-CH3)上的氫原子，說明M-PHMG被成功合成。

圖7 M-PHMG單體的1H NMR

2.3 表面形貌分析

首先將水凝膠樣品放置在PBS中在室溫下溶脹平衡24 h，然后使用液氮作為低溫劑，迅速將其凍結在冰點以下，切斷截面部分，然后將樣品容器轉移到冷凍干燥機中冷凍干燥，直至所有水升華。然后將干燥后的樣品經過噴金處理后使用導電膠粘在樣品臺上，對水凝膠樣品進行SEM測試，結果如圖8所示。由圖可得，水凝膠內部橫截面顯示出高度多孔的蜂窩狀結構，這是由于在紫外光照射下自由基聚合形成，這有利于水凝膠良好的吸水性和保水性。圖8中(a)～圖(d)圖顯示M-PHMG投入量越多，水凝膠內部孔隙直徑越小，但是當質量比Dex-MA:M-PHMG＝5∶1時，由于M-PHMG中的胍基含量較大，而胍基比羥基的親水性更加優良，導致水凝膠除了有更加致密的孔隙，部分區域還有較大的空隙。

圖8 (a)gel-1、(b)gel-2、(c)gel-3、(d)gel-4、(e)gel-5的水凝膠內部SEM圖

對織物進行SEM測試，結果如圖9所示。其中(a)和(f)為原棉織物及其局部放大圖，可見其纖維縱向呈扁平卷曲狀，表面較為平滑；接枝長鏈烷基季銨鹽后，CCT-1纖維表面變得粗糙，隨著季銨鹽投入量的增加，棉纖維表面變得更加粗糙并且出現顆粒狀痕跡；CCT-4在CCT-3的基礎上接枝KH-570，在纖維表面可以觀察到更多鱗片形的塊狀物。硅烷偶聯劑在與棉纖維發生反應時，硅氧烷上的三個甲氧基先水解生成硅烷醇，然后硅烷醇通過縮合反應與棉纖維表面的羥基反應形成-Si-OSi-共價鍵，同時，硅烷醇基團自身也會發生縮合，因此經過長鏈烷基季銨鹽和KH-570接枝后的改性棉纖維表面粗糙且分布有塊狀物。

圖9 改性棉織物SEM圖(a)CT、(b)CCT-1、(c)CCT-2、(d)CCT-3、(e)CCT-4、(f)～(g)分別為對應的放大圖

2.4 溶脹性能分析

水凝膠的溶脹性能，如圖10所示，gel-1、gel-2、gel-3、gel-4、gel-5的溶脹倍數分別為23.045倍、6.082倍、6.854倍、6.984倍、5.512倍。據圖10所知，水凝膠具有很強的溶脹能力，且水凝膠交聯密度越大則內部孔隙越小，則溶脹性能越小[9]。

圖10 不同配比水凝膠溶脹圖

2.5 定性抗菌性能分析

由于季銨鹽的抗菌方式為接觸型抗菌，通過觀察瓊脂與織物相接觸部分有無菌落生長來判斷織物是否有抗菌效果。如下頁圖11所示，移除對照組原棉CT發現接觸部分菌落正常生長，沒有任何抗菌痕跡。而CCT-1、CCT-2、CCT-3和CCT-4樣品，將改性織物移除后可以觀察到與織物接觸部分均無細菌生長，說明了改性后的棉織物都有一定的抗菌性能。

圖11 改性棉織物定性抗菌圖

2.6 定量抗菌性能分析

對改性織物以及織物復合水凝膠敷料進行定量抗菌實驗，樣品抗菌結果如下頁圖12所示。CT、CCT-1、CCT-2、CCT-3、CCT-4、CCT-4-gel對大腸桿菌的抑菌率分別為68.33%、91.67%、95.00%、96.67%、98.33%、99.83%；CT、CCT-1、CCT-2、CCT-3、CCT-4、CCT-4-gel水凝膠對金黃色葡萄球菌的抑率分別為51.38%、88.89%、91.67%、94.44%、97.22%、99.86%?？梢钥闯黾句@鹽的添加含量越大時，所制備的水凝膠材料才抗菌性能越好，而且通過CCT-4-gel可推斷季銨鹽和KH-570具有協同抗菌作用。

圖12 改性棉織物定量抗菌圖

2.7 水凝膠復合棉織物敷料的止血性能分析

小鼠斷尾出血模型止血試驗的止血時間如圖13所示。從圖13可以看出，第1組(CCT-4-gel-6)的平均止血時間約為166 s，第2組(CCT-4-gel-7)的平均止血時間約為143 s，第3組(CCT-4-gel-8)的平均止血時間約為7 s，第4組(CCT-4-gel-9)的平均止血時間約為5 s。止血時間越短，止血性能越好。

圖13 水凝膠復合棉織物敷料的止血時間圖

3 結論

本文制備了Dex-MA和M-PHMG單體，通過在棉織物上接枝十六烷基季銨鹽和KH-570制備改性棉織物，將經過改性的葡聚糖單體溶于去離子水中，再添加M-PHMG、凝血酶以及光引發劑，將改性后的抗菌織物浸泡在上述混合溶液中，通過紫外光原位交聯方式制備水凝膠基棉織物敷料。經各項性能測試，說明該水凝膠基棉織物敷料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率達到99.83%和99.86%，季銨鹽和抗菌胍鹽具有協同抗菌作用。同時，由于凝血酶的加入，該醫用敷料具有良好的止血效果，水凝膠敷料CCT-4-gel-9可實現5秒左右止血功能。水凝膠的微孔結構還具有吸附傷口滲液功能，同時保持傷口的濕潤環境，為傷口創造良好的恢復環境。