大連近岸海域表層海水中典型人工甜味劑的濃度分布及生態風險評估

岳揚，李莉，王炫凱，王侯宇，張玉鳳，張倩，劉鷹，曲寶成,*

1. 設施漁業教育部重點實驗室（大連海洋大學），大連 116023 2. 大連市檢驗檢測認證技術服務中心，大連 116023

人工甜味劑是世界上使用最廣泛的食品添加劑之一，廣泛應用于飲料、制藥配方、動物飼料添加劑和牙膏等領域[1]。我國是全球最大的人工甜味劑生產國及出口國，僅2018年，人工甜味劑產量合計約16.0萬t，其中糖精鈉（SAC）產量4.5萬t、甜蜜素（CYC）7.0萬t、阿斯巴甜（ASP）2.0萬t、安賽蜜（ACE）1.4萬t、三氯蔗糖（SUC）0.7萬t和紐甜（NEO）0.4萬t[2]。長期以來，食用人工甜味劑被認為是安全有益的。然而近年來的研究顯示，關于人工甜味劑的安全性和其對健康不良影響的爭議越來越大。Zeynep和Sifa[3]發現一定濃度的ACE（2.5 mg·L-1和5 mg·L-1）、ASP（2.5 mg·L-1）和SAC（1.5、2.5和5 mg·L-1）會增加人外周血淋巴細胞DNA的損傷，Soffritti等[4]通過對大鼠喂食16 000 mg·kg-1和32 000 mg·kg-1（以濕質量計）的ASP，發現會增加患肺癌和肝癌的風險，Schiffman和Rother[5]發現對大鼠喂食3.3～1 mg·kg-1·d-1的SUC會改變胃腸道中的微生物組成，減少有益細菌。如今，人工甜味劑已被認為是一種環境新污染物，所引發的生態和健康風險問題正在引起人們的關注[6]。這其中人工甜味劑的環境污染狀況始終是國內外學者關注的重點問題之一[7]。

研究表明，大多數人工甜味劑經人體攝入后通常不參與轉化和代謝，會直接通過尿液或糞便排出體外，使其不可避免地釋放到環境中。由于該類化合物具有一定的極性，通常易溶于水，污水處理廠（WWTP）廢水、湖泊和河流等地表水及地下水中常會有典型人工甜味劑檢出[1,8-12]。瑞典環境研究署開展WWTP及相關水體中SUC污染篩查，并首次報道了WWTP和水環境中檢出的SUC，濃度范圍為1.8～10.8 μg·L-1，附近地表水中濃度范圍為0.052～3.6 μg·L-1[8]；Subedi和Kannan[9]調查了美國奧爾巴尼亞地區4種人工甜味劑在WWTP的污染狀況，發現ASP和SAC的去除率較高（68%和90%），而SUC和ACE的去除率較低（<2%）；Gan等[10]在中國天津自來水體中發現SUC、ACE、SAC和CYC的濃度分別高達0.12 μg·L-1、0.68 μg·L-1、0.10 μg·L-1和36 ng·L-1；Loos等[11]在歐洲27個國家的河流中發現從英國、比利時、荷蘭、法國、瑞士、西班牙和意大利采集的樣品中SUC的濃度達到1 μg·L-1，德國和東歐樣品中SUC濃度較低（<100 ng·L-1）；Morlock等[12]調查了瑞士蘇黎世地區的地下水樣品中人工甜味劑濃度，發現有ACE被檢出且濃度高達4.71 μg·L-1，在近年來的研究中發現除陸地淡水中常有人工甜味劑的污染外，來自美洲[13-14]、歐洲[15-17]和亞洲[18-19]的近岸海域中也都有多種人工甜味劑的存在，其中在美國紐約港SUC的含量高達16.2 μg·L-1[14]。盡管針對海洋環境人工甜味劑污染的研究相對較少，但這些已有的研究暗示人工甜味劑存在全球污染的可能，然而當前針對人工甜味劑的環境生態風險評估研究卻較少。

大連位于遼寧省遼東半島南端，地處黃海、渤海之濱，是中國東部沿海重要的經濟、貿易、港口、工業和旅游城市。本研究以大連近岸海域（黃海）作為研究區域，開展8種典型人工甜味劑的污染特征研究，以期了解人工甜味劑在大連近岸海域的發生和分布，并基于風險商（RQ）方法進行風險評估，為當地的環境保護和生態安全提供參考依據。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 試劑與材料

ACE、ASP、NEO、CYC、SAC、SUC、阿力甜（ALI）標準品（>98%，阿拉?。┖蛺鄣氯f甜（ADV）標準品（≥95%，Sigma-Aldrich），其相關理化性質見表1；內標物SUC-d6和ACE-d4（>98%，Toronto Research Chemicals）；甲醇和乙腈（HPLC級，Spectrum）；甲酸（HPLC級，DIKMA）。

1.2 樣品采集

于2021年5月在大連近岸黃海海域采集海水樣品，采樣地點如圖1所示，涵蓋大連城區的海水浴場、海洋公園、港灣港口及市政污水排放口等地區，平均離岸距離約為300 m，主要采集表層海水（深度約50 cm），每個采樣點采集3份平行樣品。采集樣品儲存于琥珀色的聚丙乙烯瓶中，4 ℃下保存。采集的樣品使用Orion Star A329多參數分析儀（Thermo Scientific）原位測量溫度、pH、鹽度和溶解氧等參數。

1.3 樣品前處理

量取50 mL待處理的水樣，加入50 μL 1 μg·mL-1的同位素內標SUC-d6和ACE-d4，混勻。固相萃取小柱（200 mg，6 mL，Waters HLB，美國）先用6 mL甲醇和6 mL超純水（pH=3）進行活化，然后將加有內標的待處理的水樣上樣，用6 mL超純水（pH=3）淋洗固相萃取柱，真空抽干20 min后，用6 mL的甲醇溶液洗脫分析物，并將萃取液在溫和的氮氣流下蒸發至干。將干燥的殘留物用甲醇/水（V∶V=40∶60）定容至1 mL，最終提取液通過0.22 μm濾膜過濾并進行樣品分析。

表1 8種人工甜味劑的化學結構及物理化學性質Table 1 Chemical structure and physicochemical properties of 8 kinds of artificial sweeteners

圖1 中國大連地區近海水域采樣分布圖Fig. 1 Sampling distribution map of coastal waters in Dalian, China

1.4 樣品分析

使用HPLC-MS/MS分析目標提取物。通過Sciex QTRIP 6500+（SCIEX，美國）系統分離分析物。色譜柱為Waters Atlantis T3（4.6 mm×50 mm，2.7 μm，Waters，美國）；流動相分別為0.1%甲酸水溶液（A相）和0.1%甲酸乙腈（B相），流速為0.35 mL·min-1，柱溫為40 ℃，進樣量為5 μL。梯度洗脫程序從7% B相開始，保持0.5 min，5.5 min升至35% B相，7 min時達到95% B相，保持1 min，再用0.1 min回到初始7% B相，分析時間為12 min。串聯質譜儀器參數：氣簾氣為241.325 kPa，碰撞氣為62.055 kPa，霧化溫度為50 ℃，霧化氣為55，輔助氣為60；噴霧電壓為-4 500 V，采用電噴霧電離源，掃描方式為正負離子掃描模式，檢測方式為多反應離子監測；脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮氣。

1.5 質量控制

所有玻璃器皿用自來水超聲清洗30 min，再用超純水洗3次，烘干后用二氯甲烷、丙酮和甲醇各洗2次，待溶劑揮發完全后，置于馬弗爐中于450 ℃下燒3 h，自然冷卻后取出待用。

樣品在提取前添加回收率指示物標樣，以控制整個樣品前處理過程的回收率。同時進行方法空白、基質加標、基質加標平行樣及樣品平行樣的測定，以進行質量控制與質量保證。8種人工甜味劑通過內標法進行定量，用50 ng·mL-1內標混合物從0.5至100 ng·mL-1（SUC為2～400 ng·mL-1）進行6點標準曲線校正，結果顯示出良好的線性（r2≥0.99）。目標化合物的回收率為83.8%～109.8%。目標化合物的線性范圍、檢出限和定量限詳細記錄在表2中。

表2 目標化合物檢測的線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Linear range, limits of detection （LOD） and limits of quantification （LOQ） of target compounds

1.6 風險評估

使用風險商（risk quotient, RQ）方法評估了檢測到的人工甜味劑構成的生態風險[18]。將RQ計算為測得的環境污染物的濃度（measured environment concentration, MEC）除以預測的無效應濃度（predicted no effect concentration, PNEC）的商（公式（1））。PNEC值是急性或短期毒性數據（LC50或EC50）除以評估系數（assessment factor, AF）的商（公式（2））。

（1）

（2）

式中：LC50為通過生物毒性試驗獲得的半數致死濃度，EC50為半數效應濃度，檢測到的化合物的LC50或EC50值是從美國環境保護局（ecological structure activity relationship，ECOSAR v2.0模型）獲得，AF取1 000[20]。風險分類基于風險等級標準，其中RQ<0.01：“不太可能帶來風險”；0.011：“高風險”。

此外，為了評估人工甜味劑的綜合毒性，使用濃度加成模型來計算綜合風險商（MRQ）（公式（3）和（4））。

MRQ=max（STU1, STU2, ……STUm）×AF

（3）

（4）

式中：STU是毒性單位值之和；m是水生生物的類型，這里選擇了3種不同營養水平（綠藻、水蚤和魚類）的水生生物為代表；n是人工甜味劑的數量（n=8）[21]。如果MRQ的值>1，則認為對水生生物或環境存在潛在風險[21]。

1.7 數據分析

實驗數據采用Microsoft Excel 2017、Origin Pro 2019b software （Origin Lab Corporation）和ArcGIS 10.2進行整理、分析及作圖。

2 結果與討論（Results and discussion）

2.1 人工甜味劑在大連近岸海域中的污染水平

大連近岸海域人工甜味劑的污染水平，如表3所示，在12個采樣點收集的海水樣品中都檢測到了人工甜味劑。共檢測到6種人工甜味劑，濃度范圍為2（ASP）～766（SUC） ng·L-1。ACE和SUC是主要檢出的人工甜味劑，如圖2所示，平均污染水平ACE>SUC>CYC>SAC>NEO>ASP。ALI和ADV在所有采樣點均未檢出，表明ALI和ADV在當地可能極少使用。

表3 人工甜味劑的預測的無效應濃度（PNEC）值及在各站點的濃度Table 3 The predicted no effect concentration （PNEC） values and concentrations of artificial sweeteners at each site （ng·L-1）

圖2 不同采樣點人工甜味劑的污染水平Fig. 2 Accumulation levels of artificial sweeteners at different sampling points

目前國內外針對沿海近岸水域人工甜味劑污染水平的報道相對較少，本研究同現有的研究進行了比較（表4）。比較分析顯示，大連近岸海域的人工甜味劑總體濃度水平（按檢測最大濃度計）要高于北海（North Sea）[15]，顯著低于加的斯灣（Bay of Cadiz）[17]的污染水平。國內的研究顯示，人工甜味劑總體濃度水平略高于中國香港維多利亞港[19]，但顯著低于中國天津渤海[10]的污染水平。不同國家及中國不同地區近岸海域中人工甜味劑的污染水平差異，可能來源于所研究地區的人口密度、飲食習慣及人工甜味劑的生產和消費的差異。特別的，中國天津渤海[10]中人工甜味劑的總濃度比大連近岸海域的人工甜味劑總體濃度水平要高約60倍。在其他環境污染物檢測中，也發現類似的現象，例如抗生素[22]、有機磷酸酯[23]和鄰苯二甲酸酯[24]等，均表現出渤海的污染水平要高于黃海，這可能與環渤海地區的城市貢獻及主要河流匯集相關。

2.2 人工甜味劑在大連近岸海域中的污染分布

大連近岸海域人工甜味劑的污染分布，如圖3所示。監測結果表明，大連近岸海域普遍存在人工甜味劑的污染。與其他站點相比，站點S1及站點S2的人工甜味劑總體濃度水平較高，原因可能是該站點位于入海排污口和大連灣港口附近，WWTP的污水排放及港口區域其他污染排放綜合作用導致。在本研究中，站點S1和S2的SUC濃度要遠高于其他站點，平均濃度分別為764 ng·L-1和760 ng·L-1，除站點S1和S2外，其余站點的SUC濃度水平則相對較低（32～177 ng·L-1），與Xie等[18]報道的中國遼東半島地區SUC濃度水平相似。站點S12的人工甜味劑總體濃度水平最低，該站點位于海帶養殖區，人們活動相對較少。站點S6的總體濃度水平要高于S7，表明人工甜味劑的濃度水平可能受到離岸距離的影響，這一結果也與Xie等[18]的研究結果一致。從功能區上來看，人工甜味劑濃度水平由大到小排列為：排污口、港口附近（S1～S4）>旅游景區（S6、S7、S9）>碼頭（S11）>濱海浴場、濱海公園（S5、S8、S10）>養殖區（S12），表明人工甜味劑的濃度水平可能與人們的活動有關，WWTP的出水和近岸附近的其他污染排放是人工甜味劑進入海洋的主要來源。

表4 人工甜味劑在不同地區近岸海域的污染水平Table 4 Pollution levels of artificial sweeteners in coastal water in different regions （ng·L-1）

圖3 人工甜味劑在大連近岸海域的污染分布Fig. 3 Pollution distribution of artificial sweeteners in coastal waters of Dalian

2.3 生態風險評估

為評估人工甜味劑殘留對海洋生態環境的不利影響，在RQ的基礎上對6種目標人工甜味劑的生態風險進行了評估。本研究利用PNEC和MEC對影響綠藻、水蚤和魚類的目標化合物進行了風險評估。根據PNEC值和檢出最大的MEC值計算RQ。結果表明，大連近岸黃海海域中目標人工甜味劑對綠藻、水蚤和魚類均不太可能帶來風險（RQ<0.01）。

單一化學品的風險評估，僅能提供海洋生態環境影響的部分信息。為此，進一步進行了累積風險評估，結果表明本研究中人工甜味劑混合風險商數值（MRQ）在0.002和0.004之間，其中SAC和NEO因其PNEC值較低，其貢獻占采樣點MRQ的94%以上（圖4）。本研究也對渤海灣（天津）的污染水平進行了累積風險評估，結果顯示其已對近岸海洋生態環境帶來低風險。Wiklund等[25]的研究已表明SUC對水體中水蚤行為會產生影響。盡管本研究的結果顯示現階段這些人工甜味劑對大連近岸黃海海域的水生生物不太可能構成生態風險。但由于大連瀕臨黃海、渤海，且這些人工甜味劑在大連近海已表現出高頻檢出，因此有必要對大連近岸海域中的人工甜味劑進行更密切的長期監測。

圖4 大連近岸海域中人工甜味劑綜合風險商（MRQ）的占比Fig. 4 Proportion of mixture risk quotient （MRQ） of artificial sweetener in Dalian coastal waters

本研究對大連近岸海域中表層海水8種典型人工甜味劑的污染水平進行了研究，有6種人工甜味劑能夠被檢測到，其中SUC和ACE的環境污染濃度水平較高，濃度范圍分別為32～766 ng·L-1和103～557 ng·L-1。綜合污染水平顯示國內外不同海域污染水平差異顯著，其中，大連黃海近岸海域人工甜味劑的污染水平低于渤海海域。污染分布顯示人工甜味劑的濃度水平排序為：排污口、港口附近（S1～S4）>旅游景區（S6、S7、S9）>碼頭（S11）>濱海浴場、濱海公園（S5、S8、S10）>養殖區（S12），表明人工甜味劑的濃度水平與人們的活動有關。生態風險評估結果表明，現階段目標人工甜味劑對大連近岸水生生物不太可能產生生態風險。