脾氣虧虛與腹膜間皮細胞內質網應激誘導自噬的關系探討

孟立鋒，吳敏華，劉前程，楊端云，史 偉，樊均明

(1廣西中醫藥大學第一附屬醫院腎內科，國家中醫藥管理局重點?？?，廣西 南寧 530023； 2西南醫科大學中西醫結合器官纖維化實驗室，四川 瀘州 646000； 3四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室，四川 成都 610041)

腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是終末期腎病患者的腎臟替代療法之一。與血液透析相比，PD可以較好地保護殘余腎功能，同時其早期生存率較高。目前使用PD的人數在欠發達國家快速增加，尤其是在中國[1]。對經濟欠發達地區而言，PD已成為大部分終末期腎病患者行血液凈化方式的首要選擇。近年來國內外有學者提出PD優先的原則[2]，但長期過度使用PD會導致間皮下細胞基外沉積、新生血管形成等結構和功能的改變。研究表明，在PD開始后4～5 年內，約50%的患者出現腹膜超濾功能衰竭，轉為血液透析[3]。腹膜超濾功能衰竭的主要因素是腹膜纖維化(peritoneal fibrosis，PF)，同時它也是患者退出PD的首要因素。PF最重要的特征就是腹膜間皮細胞(peritoneal mesothelial cells，PMC)逐漸向間充質細胞轉分化，這是PF的早期階段和可逆過程，在PF的發生、發展中起著關鍵作用[4]。因此，針對性干預PMC的上皮細胞-間充質轉分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)進程是防治PF的重要靶點，開發延緩或逆轉EMT進程的技術或藥物就成為研究者所關注的重要課題。

自噬對真核細胞維持穩態和實現更新有重要意義。自噬與PF的發生發展密切相關。研究表明，抑制自噬可減少人PMC EMT發生[5]。內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是細胞內質網穩態受到體內外因素破壞時,維持細胞生存的一種自我保護機制；調控PMC ERS可以保護PMC避免受到轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)誘導的EMT[6]。ERS可誘導細胞發生自噬。針對性干預ERS誘導的自噬活性可能是防治EMT發生的重要靶點。

PF的發病機制復雜，目前缺乏有效防治措施。中醫藥在預防或延緩PF方面做了很多積極的研究。近年的相關研究發現，具有益氣功效的中藥及其制劑可能具有干預細胞ERS[7]、進而干預EMT進程、防治PF的作用。我們既往的研究發現脾氣虧虛是 PD相關的腹膜早期病變的主要病機[8]，而EMT又是PF的早期事件[9]。因此，我們認為脾氣虧虛與PMC ERS誘導的自噬有密切相關性，本文就二者之間的關系進行探討，以期從健脾益氣著手防治PD誘導的EMT，為中醫藥干預PF提供新策略。

1 PMC EMT是PF的早期階段和可逆過程

腹膜是體內面積最大的漿膜組織，由PMC、基底膜和結締組織組成類似“三明治”的結構。PMC對維持腹膜內環境穩態起重要作用，在非生理性的PD液、腹膜炎等因素的反復刺激下開啟自我修復的程序，從而引起腹膜形態的改變[10]，促進了PF的形成。

PF的初始因素是PMC損傷。2003年YANEZ-MO首次發現PMC EMT的現象。EMT是一個復雜的動態演變過程，包括重新排列細胞結構，調節細胞分子水平及促進新生化標志物的表達。在長期PD過程中，損傷了PMC層，導致PMC逐漸失去上皮細胞形態學特征，而呈現纖維母細胞樣表型，參與進行性纖維化及新生血管形成，腹膜通透性被改變，使腹膜溶質轉運能力和超濾能力逐漸下降，最終導致腹膜超濾功能衰竭[11-12]。國內有學者研究表明扶腎顆粒、健脾益氣方、扶腎方等中藥復方可能通過干預大鼠PMC EMT進程，進而延緩PF的進展[13-15]?？梢?，EMT是PF的早期階段和可逆過程，開展中醫藥針對PMC EMT進程防治PF的研究，體現了傳統醫學“既病防變”的理念。

2 PMC ERS及其誘導的自噬參與了EMT進程

內質網作為細胞內最大的膜網絡結構，主要承擔蛋白質的合成、折疊、修飾、組裝和運輸的重任。當內質網穩態受到破壞時，可能導致錯誤/未折疊蛋白在內質網中大量積聚，激活ERS。當發生ERS時，內質網通過啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)來保護細胞和修復細胞的損傷。適度的ERS可啟動適應性UPR，恢復內質網及內環境穩態，維持細胞生存；但嚴重或持續的ERS使保護機制不能與損傷抗衡，導致細胞損害甚至發生凋亡。大量證據表明，ERS參與器官纖維化，在間皮細胞表型轉化和凋亡中起到重要作用，ERS可以誘導肺臟和腎臟間皮細胞EMT改變，進而導致纖維化積聚[16-17]。

SHIN等[6]研究表明，PD可使PMC發生ERS，ERS參與并誘導人PMC EMT和凋亡，調控ERS可以預防TGF-β1引起的腹膜損傷。體外培養的人PMC經ERS激活劑衣霉素刺激12 h，可以出現EMT改變，當去除衣霉素干預后，EMT改變得到逆轉；延長衣霉素刺激至48 h，EMT改變不能逆轉；提示逆轉ERS誘導的EMT呈時間依賴方式。衣霉素預處理人PMC，可以對TGF-β1誘導的EMT和凋亡起到保護作用。進一步研究發現ERS阻滯劑牛熊去氧膽酸可以改善TGF-β1誘導的EMT，說明ERS不能直接誘導EMT，但ERS是TGF-β1誘導的EMT中的主要調節因子。以上研究表明，激活ERS或阻斷過度的ERS是保護PMC的重要靶點[6]。

自噬是細胞應激時啟動的一種依賴于溶酶體降解的程序，通過降解錯誤折疊蛋白質或清除受損的細胞器來維持真核細胞的穩態。1,25(OH)2D3通過干預mTOR信號通路影響高糖誘導的人PMC自噬，進而干預EMT進程[18]。體外研究表明，脂多糖誘導自噬能觸發PMC產生自主防御機制以應對大腸桿菌感染[19]。國內學者研究發現，硫化氫對高糖誘導的人PMC損傷有保護作用，其機制可能與硫化氫抑制細胞自噬有關[20]。因此，自噬是一種保護性機制。當PMC受到致病因素損傷時，增加自噬水平可以維持細胞內穩態，從而保護細胞。

多項研究表明，ERS可通過多種分子機制誘導細胞發生自噬，減輕內質網壓力并促進細胞生存，且在長期應激條件下觸發凋亡途徑。多數研究表明，ERS誘導的自噬起到促進細胞存活的作用，但高強度或持久的應激可啟動細胞依賴自噬的死亡程序[21-22]。由于兩者間關系復雜，并且與PMC EMT有密切關系。因此，更好地了解ERS與自噬促生存或促凋亡信號轉變的關鍵節點，通過治療性干預ERS通路的靶分子來調控自噬從而減輕內質網壓力，延緩EMT，有望為PF的治療提供新的思路。

3 PMC ERS可能通過需肌醇激酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α)/X盒結合蛋白1(X-box binding protein 1, XBP1)通路誘導自噬，進而導致EMT

ERS是分泌型細胞的經典特征，由內質網表面的內質網分子伴侶蛋白[葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)]和三種跨膜信號蛋白[雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內質網激酶(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、IRE1和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)]介導。其中，GRP78是ERS和UPR激活的標志物[23]。當錯誤折疊或未折疊蛋白在內質網內堆積，內質網處于應激狀態時，GRP78與感受器蛋白解離，在內質網腔執行蛋白折疊功能。通過IRE1/XBP1、PERK-eIF2α和ATF6-ERSE三條信號通路完成UPR，調控細胞內蛋白質翻譯、折疊和降解能力以適應內環境紊亂。

有研究表明，PERK通過eIF2α磷酸化阻止ATF4等蛋白轉錄，ATF4通過調控ATG轉錄基因如Atg5、Atg7、Atg10激活自噬，而且在過度ERS時通過降解XIAP和CHOP蛋白激活凋亡[24]。ATF6則通過 XBP1和CHOP調控自噬和凋亡[25]?？梢?，PERK-eIF2α和ATF6-ERSE通路不能直接調控自噬，IRE1/XBP1通路則與自噬有直接關系。IRE1/XBP1通路中IRE1是ERI型跨膜蛋白，在人體中存在α和β兩種異構體，IRE1β只在小腸表達，而IRE1α在各個組織均有表達。IRE1α同時具有蛋白激酶和核酸內切酶活性，在發生ERS時，活化的IRE1α與底物XBP1的前體mRNA分子結合，移碼剪接成具有活性的轉錄因子剪接型X- 盒結合蛋白1(spliced X-box binding protein 1，XBP1s)，激活UPR，起到保護細胞，促進細胞生存的作用。

IRE1α/XBP1通路把內質網穩態、自噬和EMT聯系起來，是一個重要的橋梁。一系列研究證實其在EMT調節中的新作用。有研究表明，在ERS的早期階段，磷酸化的IRE1α通過c-jun 氨基末端蛋白激酶解離自噬相關蛋白Beclin1/Bcl-2，近而激活自噬[26]，XBP1通過激活Beclin1觸發自噬[27]。最近有研究表明ERS通路IRE1α/XBP1在腫瘤細胞EMT進程中起重要作用[28]。有研究表明，ERS通過激活GRP78、XBP1等蛋白，引起肺泡上皮細胞、近曲小管上皮細胞出現EMT改變[29]。PD患者PMC GRP78的表達與PMC EMT程度呈正相關[6]。體內和體外實驗發現，XBP1s抑制劑可顯著減輕高糖誘導的腹膜形態學改變及PF[30]，這些研究表明ERS通路IRE1α/XBP1可能與PMC的自噬及EMT改變有密切關系。因此我們推測，ERS通路IRE1α/XBP1可能是PD誘導PMC自噬、發生EMT改變的主要分子機制。調控IRE1α/XBP1通路影響PMC ERS及其誘導的自噬活性，激活其適應性保護機制，可能是預防PMC EMT發生的新靶點。

4 PMC ERS及其誘導的自噬可能是脾氣虧虛的微觀機制

PD的原理主要是利用腹膜完成血液與PD液之間的溶質交換，從而實現血液凈化。但長期過度使用PD會導致腹膜損傷，出現腹膜結構和功能的改變。通過對252例接受PD≥3個月的患者進行中醫證候的分析，發現PD初期以脾腎氣虛證多見[31-32]?！端貑枴嵴摗分刑岢觥捌⒅鞔蟾埂?，說明腹膜功能與脾關系密切。大量的PD液灌入腹腔，造成人為的“水濕困脾”，長期容易損傷脾氣，出現脾氣虧虛的癥狀。曹曼等[33]研究表明，加味參苓白術散可改善患者的PD功能，降低血清中PF指標(TGF-β1、纖維連結蛋白)。我們的研究以60例持續性不臥床PD患者為研究對象，發現健脾益氣法能顯著改善患者疲倦乏力、納差等臨床癥狀，而且能降低PD透出液中TGF-β1、血管內皮生長因子的表達水平，從而保護腹膜功能[34]。脾氣虧虛是腹膜早期病變的主要病機，而EMT是PF的早期階段和可逆過程。因此，我們認為脾氣虧虛與PMC EMT有密切關系，健脾益氣法可能起到延緩或逆轉EMT的作用。

有諸內，必形諸外。既然PD早期腹膜病變與脾氣虧虛密切相關，那么PMC損傷的病理機制也應與脾氣虧虛有關。中醫理論認為脾主運化水液，指脾對水液的吸收、轉輸和布散功能。脾氣健旺才能正常發揮運化水液的功能，水液在體內不停滯才能有效防止痰濕氣、水飲等病理產物的產生。如果脾氣虧虛，運化功能減退，則導致津液代謝障礙，多余的水液停留在局部，即可產生痰飲、濕濁等病變。

內質網具有完成蛋白質的合成和運輸的功能，這與中醫“脾主運化水液”的功能相似。當PMC受到致病因素損傷時， 即發生ERS(脾氣虧虛、失于運化)，內質網內合成的蛋白質得不到及時的轉運，錯誤/未折疊蛋白質在內質網中蓄積。此時，內質網通過啟動UPR和誘導細胞自噬來保護PMC和修復細胞的損傷，從而維持細胞內環境穩態，有利于細胞存活。有研究表明，補脾方藥能改善脾陰虛糖尿病認知功能障礙，其機制可能與調節下丘腦中自噬及ERS相關[35]。邱靜[36]研究表明，加減薯蕷丸通過上調自噬水平和減輕內質網負荷，從而對APP/PS1雙轉基因小鼠的神經元起到保護作用。我們的研究表明，健脾益氣方能有效減輕PD微炎癥狀態誘導的PMC損傷[15]。因此，我們推測健脾益氣法可能通過調控IRE1α-XBP1通路影響PMC ERS及其誘導的自噬活性，激活PMC的適應性保護機制，延緩或逆轉EMT。

5 結語

綜上所述，結合目前中醫藥防治PF的研究成果及我們已有的工作基礎，針對PMC ERS及其誘導的自噬在EMT中的發生機制與“脾氣虧虛”有密切相關性，進一步研究健脾益氣功效的中藥，通過調控IRE1α/XBP1通路影響PMC ERS及其誘導的自噬活性，激活其適應性保護機制，逆轉或延緩EMT進程，進而保護PMC結構和功能。這不僅為闡明ERS誘導PMC自噬在EMT中的發生機制提供重要的實驗數據，而且對進一步開發有效保護腹膜功能和防治PF的中藥方劑提供新的思路和方法。