β-氨基酸聚合物用于協同增效逆轉白色念珠菌對伊曲康唑的耐藥性

馬凱茜， 張東輝， 施 超， 顧佳蔚， 劉潤輝

（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室, 超細材料制備與應用教育部重點實驗室,教育部醫用生物材料工程研究中心, 材料科學與工程學院, 上海 200237）

微生物感染嚴重威脅著人類的生命健康，同時抗生素的濫用導致微生物不斷出現耐藥性，造成了巨大的社會問題和經濟損失[1-7]，而其中的真菌感染問題已經日益嚴峻[8]。近些年，全球范圍內的真菌感染發病率顯著上升，并且系統性真菌感染常常伴隨著高死亡率，其中感染白色念珠菌（C. albicans）的死亡率通?？沙^50%[9-12]。白色念珠菌是一種機會性致病菌，在人體黏膜和環境中廣泛存在。當人體健康時，即使攜帶白色念珠菌也往往不會出現任何癥狀，而一旦體內微生物群發生紊亂或免疫系統出現異常時，其便可能表現出毒力[13,14]。在各類抗真菌藥物中，伊曲康唑（Itraconazole）由于具有廣譜抗真菌活性、低毒性、能夠進行系統性給藥、便宜易得等優勢，在臨床中被廣泛使用[15-17]。然而，由于唑類藥物的濫用，白色念珠菌對伊曲康唑的耐藥性已經非常嚴重[18-20]。

伊曲康唑主要通過與靶酶-甾醇14α-去甲基化酶(由ERG11基因編碼)特異性結合從而抑制膜上麥角甾醇的合成來發揮抗真菌作用。真菌對伊曲康唑產生耐藥性的主要原因包括ERG11基因的過表達提高了胞內靶酶的豐度，以及藥物外排泵的過表達降低了胞內的有效藥物濃度[21-23]。這啟發我們用能夠干擾菌膜的聚合物協助伊曲康唑，提高真菌對其攝取效率和胞內藥物濃度，通過協同增效來逆轉真菌對伊曲康唑的耐藥性，而具有抗真菌活性的聚合物是實現協同增效的理想選擇。許多天然宿主防御肽具有抗真菌活性，這些抗真菌肽通常具有正電荷和疏水性兩親性結構，其作用方式主要是針對帶有負電性的真菌細胞膜[24-30]。然而宿主防御肽成本高昂、不耐蛋白酶水解等缺點限制了其應用[31-35]。β-氨基酸聚合物是宿主防御肽的模擬物，通過合理設計可實現抗真菌活性，同時具有穩定性高、生物相容性好、合成方法簡單、價格低廉的突出優勢[36-38]。

本文設計了β-氨基酸聚合物來研究其與伊曲康唑的協同抗真菌活性。前期研究證實聚N(α)-Z-DL-2,3-二氨基丙酸N-羧基硫代羰基環內酸酐(Poly-DAP)具有高效抗真菌性質[39]。本文采用DAP作為模擬宿主防御肽的正電荷部分、DL-β-正亮氨酸N-羧基硫代羰基環內酸酐(Bu)作為疏水性部分，通過本課題組近期建立的反應條件溫和、對水分不敏感的β-氨基酸N-硫代羧基酸酐(β-NTA)開環聚合的方法獲得了β-氨基酸聚合物((DAPxBuy)n)[40]?？咕鷾y試、溶血測試和細胞毒性測試表明，(DAPxBuy)n聚合物能實現高效協同增效，逆轉了真菌對伊曲康唑的耐藥性，且聚合物本身基本不引起明顯的溶血和細胞毒性，展示出其在真菌感染治療領域的應用潛力。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

DAP、Bu按文獻[40]合成；石油醚(PE)、四氫呋喃(THF)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、三氟乙酸(TFA)、溴化氫的醋酸溶液(w= 33%， HBr-HOAc)、甲基叔丁基醚(MTBE)、甲醇(MeOH)、二甲基亞砜(DMSO)、聚乙二醇辛基苯基醚(TX-100)：上海泰坦科技股份有限公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、對叔丁基芐胺(tBuBz-NH2)、伊曲康唑：上海阿拉丁生化科技有限公司；洛斯維帕克紀念研究所1640培養基(RPMI 1640)：賽默飛世爾科技(中國)有限公司；3-嗎啉丙磺酸(MOPS)：Sigma Aldrich；酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(YPD)：青島海博生物技術有限公司；達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)：GE醫療；氘代試劑重水(D2O)：上海笛柏化學品技術有限公司；超純水和去離子水由彤迪科學儀器(上海)有限公司生產的MING-CHE-24 UV系列純水機制備。

1.2 測試與表征

核磁共振波譜(NMR)：瑞士Bruker公司Ascend 600 MHz型儀器，D2O作為溶劑；酶標儀：美國Molecular Devices公司，型號為SpectraMax M2。

1.3 實驗步驟

1.3.1 (DAPxBuy)n聚合物的合成 采用本課題組文獻[40]的β-NTA開環聚合方法，合成了一系列正電荷兩親性聚合物(DAPxBuy)n(x、y分別為單體DAP、Bu的投料摩爾分數，x+y=1，n=20)。以(DAP0.5Bu0.5)20的合成為例，合成路線如圖1所示。在氮氣保護的手套箱內，稱量單體DAP (14.02 mg，0.05 mmol)、Bu (9.36 mg，0.05 mmol)及引發劑tBuBz-NH2(0.82 mg，0.005 mmol)，用總共0.5 mL的DMF溶解后在室溫下反應，通過柱層析硅膠板監測反應。反應結束后使用1.5 mL THF潤洗反應瓶并轉移至50 mL離心管，加滿-20 ℃ PE離心、沉淀，倒掉上清液并重復此操作兩次。將固體置于真空皿中真空干燥后，加入4 mL HBr-HOAc和TFA的混合溶液(體積比為1∶1)脫保護12 h，吹干溶劑，用1 mL甲醇溶解，加入49 mL、-20 ℃ MTBE沉淀、離心，重復3次，真空干燥。將固體用超純水溶解，0.45 μm過濾頭過濾后凍干，即得聚合物(DAP0.5Bu0.5)20。(DAPxBuy)n聚合物的核磁共振氫譜表征結果如圖2所示。

圖 1 （DAPx Buy）n系列β-氨基酸聚合物的合成Fig. 1 Synthetic route of (DAPx Buy)n series of β-amino acid polymers

圖 2 系列聚合物的1H-NMR圖譜Fig. 2 1H-NMR spectra of series of polymers

1.3.2 (DAPxBuy)n聚合物的最低抑菌濃度測試 配制YPD肉湯。稱量50 g YPD固體于1 L去離子水中，115 ℃滅菌15 min。

配制RPMI 1640培養基。稱量30.34 g MOPS，加入一包RPMI 1640粉末，溶于1 L去離子水中，0.22 μm過濾頭過濾。

從C. albicans(K1菌株)涂板的瓊脂上取一個菌落于10.0 mL YPD中，倒入滅過菌的錐形瓶，置于30 ℃搖床中培養15 h，用RPMI 1640清洗一次后，稀釋至2.5×103CFU/mL待用。將聚合物用超純水配成1 mg/mL，在96孔板中用RPMI 1640以兩倍梯度稀釋的方法將聚合物稀釋到最終質量濃度為0.1～25 μg/mL，將伊曲康唑用DMSO稀釋至8 mg/mL，兩倍梯度稀釋至最終質量濃度為0.1～200 μg/mL，每個孔的液體體積為100 μL。再取100 μL待用菌液分別加入到稀釋好的聚合物和伊曲康唑中。另外96孔板最后一列不加藥物，前4個孔加純RPMI 1640作為陰性對照，后4個孔加等體積的RPMI 1640和菌液作為陽性對照。將96孔板置于30 ℃培養箱孵育24 h，之后肉眼觀察實驗結果，恰好看不到有真菌生長的最低濃度即為樣品的最低抑菌濃度(MIC)[37]。每個樣品至少在不同的時間重復測試2次。

1.3.3 棋盤格協同抗真菌測試 待用菌液的配制同“1.3.2”節部分。將聚合物用超純水配成1 mg/mL，在96孔板中用RPMI 1640橫向以兩倍梯度稀釋的方法將聚合物稀釋到最終質量濃度為0.1～25 μg/mL，每個孔的液體體積為50 μL。伊曲康唑用DMSO稀釋至2 mg/mL，在96孔板中用RPMI 1640縱向兩倍稀釋至最終質量濃度為0.1～50 μg/mL。保持方向不變，轉移50 μL稀釋好的伊曲康唑到稀釋聚合物的96孔板中。然后加入100 μL待用菌液，最終每個孔的體積為200 μL。每塊96孔板的最后一列前4個孔和后4個孔分別作為陰性和陽性對照。將96孔板置于30 ℃培養箱孵育24 h，之后肉眼觀察實驗結果，記錄樣品的MIC。每個樣品至少在不同時間重復測試2次。

協同活性用協同指數(FICI)進行判斷。FICI按照式(1)進行計算：

式中，A和B分別代表兩種藥物，combined和alone分別代表聯合使用兩種藥物和單獨使用一種藥物。當FICI ≤ 0.5時，表示兩種藥物存在協同作用；當0.5 ＜ FICI ≤ 4時，表示兩種藥物不存在相互作用；當FICI ＞ 4時，表示兩種藥物存在拮抗作用。

1.3.4 (DAPxBuy)n聚合物的溶血率測試 稱取0.61 g Tris和4.39 g氯化鈉，溶于500 mL去離子水中，121 ℃滅菌15 min，即制得TBS緩沖液。

向1 mL新鮮人血中加入19 mL TBS緩沖液，輕輕混勻后以4 000 r/min離心3 min，倒掉上清液，重復操作3次。最后用TBS將人血稀釋至體積分數5%得到待用血紅細胞懸液。在96孔板中，用TBS將聚合物以兩倍梯度稀釋的方法稀釋至最終質量濃度為12.5～400 μg/mL，最后一列加入等體積的TBS和體積分數0.1%的TX-100分別作為陰性和陽性對照。然后向每個孔中加入等體積的血紅細胞懸液，在37 ℃的培養箱中孵育1 h。取出96孔板，以3 700 r/min的轉速離心5 min，然后吸出80 μL上清液用酶標儀讀光密度(OD)值(405 nm)并計算溶血率。 每個樣品重復3組實驗。

1.3.5 (DAPxBuy)n聚合物的細胞毒性測試 稱量0.5 g的MTT，溶于100 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，制得MTT溶液。

NIH3T3（小鼠胚胎成纖維細胞系）用DMEM培養基于37 ℃ CO2培養箱中培養，當培養皿中的細胞達到90%～95%的黏附率時，吸走DMEM培養基，用PBS潤洗，再用胰蛋白酶和DMEM處理。以1 340 r/min離心、清洗，并用DMEM將細胞稀釋至1.0×105cell/mL待用。在96孔板中加入100 μL細胞懸液，置于CO2培養箱，24 h后除去培養基。將聚合物兩倍梯度稀釋至最終質量濃度為6.25～400 μg/mL，轉移100 μL到除去培養基的96孔板中，對照組加入100 μL DMEM，其中不含細胞的作為陰性對照，含有細胞的作為陽性對照，置于37 ℃CO2培養箱中。24 h后，向板中加入10 μL MTT溶液，在CO2培養箱孵育。4 h后，去除培養基，然后加入150 μL DMSO，置于搖床中搖晃。15 min后，用酶標儀讀OD值(570 nm)并計算細胞存活率。每個樣品重復3組實驗。

2 結果與討論

2.1 聚合物的協同抗菌活性

(DAPxBuy)n聚合物及伊曲康唑對C. albicans(K1菌株)的抑菌活性、聯合使用聚合物與伊曲康唑的MIC值，以及通過計算得到的協同指數FICI，如表1所示。結果表明，單獨使用聚合物時，其抑菌活性隨著主鏈疏水基團Bu比例的增多而降低，單獨使用伊曲康唑時，即使藥物質量濃度達到200 μg/mL也無法完全抑制C.albicans的生長。當聯合使用時，所有(DAPxBuy)n聚合物與伊曲康唑的FICI均小于0.5，表明這5種(DAPxBuy)n聚合物與伊曲康唑均存在協同效應，伊曲康唑的MIC可從單獨使用時的大于200 μg/mL降低到協同后的3.1 μg/mL，說明(DAPxBuy)n聚合物可通過協同增效有效逆轉C. albicans對伊曲康唑的耐藥性，使伊曲康唑抗真菌活性從無效轉變為高效。

表 1 聚合物與伊曲康唑的MIC、FICI及相互作用模式Table 1 Interaction modes of polymers and itraconazole and their MIC and FICI values

C. albicans在不同質量濃度藥物聯合使用下的生長情況如圖3所示。白色代表此質量濃度下兩次實驗均無肉眼可見的真菌生長，淺藍色代表有一次實驗有真菌生長，深藍色代表兩次實驗均有真菌生長。從圖中可以明顯看出，聯合使用(DAPxBuy)n聚合物和伊曲康唑后，兩者可以在各自最多四分之一MICalone的條件下成功抑制真菌生長。

圖 3 C. albicans (K1菌株)在不同質量濃度藥物聯合作用下的生長情況Fig. 3 Growth of C. albicans (strain K1) incubated with different mass concentrations of polymers and itraconazole

有報道提出，宿主防御肽的正電荷和疏水性兩親性特性使它能夠改變微生物細胞膜的通透性，從而使更多抗菌藥物進入胞內，宿主防御肽進而得以發揮協同增效作用[41,42]。結合由于真菌靶酶基因及藥物外排泵基因過表達而導致其對伊曲康唑產生耐藥性的機理，我們推測宿主防御肽模擬物(DAPxBuy)n聚合物可能表現出類似的協同機理，即通過改變真菌細胞膜通透性使更多伊曲康唑進入胞內，從而實現逆轉真菌對伊曲康唑的耐藥性。

2.2 聚合物的溶血率

(DAPxBuy)聚合物的溶血率如圖4所示。4組樣品的50%溶血時的藥物濃度(HC50)均大于400 μg/mL，溶血率較低，血液安全性良好，(DAP0.6Bu0.4)20的HC50為200 μg/mL，溶血率較其他樣品略微增強。同時，除(DAP0.5Bu0.5)20外，其余樣品的溶血率隨疏水基團Bu含量的提高而變大。(DAP0.5Bu0.5)20的反?，F象仍在研究中。

圖 4 系列聚合物的溶血率Fig. 4 Hemolysis rates of series of polymers

2.3 聚合物的細胞毒性

聚合物的細胞毒性實驗結果如圖5所示。從圖5可以看出，(DAPxBuy)n聚合物的質量濃度在6.25～400 μg/mL，均沒有產生明顯的細胞毒性。所有聚合物的抑制50% NIH 3 T3成纖維細胞生長的質量濃度(IC50)都在400 μg/mL以上。綜合考慮“2.1”節中各聚合物的MIC及“2.2”節中的溶血率，認為(DAPxBuy)n聚合物對真菌和哺乳動物細胞具有比較好的選擇性。

圖 5 聚合物的細胞毒性Fig. 5 Cytotoxicity of polymers

3 結 論

（1）(DAPxBuy)n聚合物能實現高效協同增效，逆轉了C. albicans對伊曲康唑的耐藥性，使伊曲康唑的抗真菌最低抑制濃度從單藥的高于200 μg/mL降低至協同后的3.1 μg/mL，即從原先的無效逆轉為高效抗真菌活性。

（2）(DAPxBuy)n聚合物在400 μg/mL的質量濃度下基本不會造成明顯人血紅細胞溶血和細胞毒性。