血紅素加氧酶1對肝缺血再灌注損傷的細胞保護機制進展

楊軼涵，展希，方育

(昆明醫科大學第一附屬醫院麻醉科，昆明 650032)

在臨床工作中，肝部分切除術、肝移植、休克、嚴重創傷等治療后會不可避免地發生肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI)，它是術后肝功能障礙和移植后器官排斥的主要原因[1]。在HIRI的病理生理機制中，肝細胞、庫普弗細胞、肝竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)等發揮重要作用。在肝臟缺血階段，肝組織內細胞線粒體功能障礙和酸性代謝產物積累干擾了細胞的主動跨膜轉運，最終導致肝細胞發生水腫甚至壞死?；謴透闻K血流即再灌注時，在線粒體氧化磷酸化功能障礙的基礎上免疫介導的庫普弗細胞被激活，兩者共同產生大量活性氧使氧化應激和炎癥級聯反應增強，故肝臟血流恢復后加重了組織損傷[2]。同時，LSEC可表達黏附分子和趨化因子，引起肝臟微循環障礙，進一步加重HIRI。目前，缺血預處理、缺血后處理、針對HIRI病理生理機制和靶點的藥物治療、機械灌注是治療HIRI的主要策略，雖然這些方法的保護作用已在動物研究中得到驗證，但在臨床應用和療效方面還存在爭議[3]。因此，全面了解HIRI潛在的機制和作用靶點可有效改善肝臟損傷，達到更好的治療效果。有研究表明，血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)-1上調對改善HIRI起重要保護作用，但HO-1在肝臟中的表達調控復雜，不同肝臟細胞類型可能通過一條或多條信號通路觸發HO-1基因的表達[4-6]。目前HO-1對這些細胞的保護機制尚未完全明確，而通過深入研究HIRI的機制來改善術中HIRI的治療方案成為目前研究的主要方向?，F主要闡述在HIRI中HO-1發揮選擇性細胞保護作用的相關機制及進展。

1 HO-1的生物學特性

HO是體內血紅素分解代謝的限速酶，能將游離血紅素分解成一氧化碳、游離鐵和膽綠素。目前已鑒定出3種哺乳動物源性HO異構體，一種為誘導型同工酶HO-1，可提供針對氧化應激的保護，另外兩種組成型表達同工酶為HO-2和HO-3，HO-2主要在腦和睪丸中表達，HO-3則在組織中表達較低[7]。在穩態條件下，除脾臟和肝臟的巨噬細胞以及一些耐受性免疫細胞外，HO-1在大多數細胞和組織中低表達或不表達。在應激條件下，HO-1的誘導則是細胞免受損傷的適應性保護機制，HO-1基因的表達存在多個轉錄調控因子，主要與氧化還原敏感轉錄因子、核轉錄因子紅系2相關因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)、細胞應激反應相關的蛋白激酶通路[如p38促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、c-Jun氨基端激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)]有關[7-8]。因此，HO-1的特性決定其成為目前研究的一個主要方向，HO-1及其產物在心、腦、肝、腎等器官保護方面均有文獻報道，可發揮抗氧化應激、抗炎、抗凋亡、免疫調節等作用。Nakamura等[9]也證明了在人類肝移植術后移植物部位HO-1水平與原位肝移植患者的臨床結局相關，低水平的HO-1伴隨患者肝功能的惡化和生存率降低。

2 HO-1在HIRI中的細胞保護機制

2.1HO-1對巨噬細胞的保護機制

2.1.1巨噬細胞與HIRI 肝臟巨噬細胞是HIRI中免疫反應的關鍵，巨噬細胞分為組織駐留巨噬細胞(稱為庫普弗細胞)和血液/骨髓源性巨噬細胞(稱為循環血液的單核細胞)。在肝臟健康狀態下，庫普弗細胞是肝臟適應性免疫耐受反應的中心，主要負責清除流經肝臟循環血液中的抗原，將它們呈遞給調節性T細胞，誘導耐受性T細胞反應并產生免疫抑制細胞因子(如白細胞介素-10)，使肝臟保持免疫耐受[1,10]。HIRI時，鄰近損傷肝細胞釋放的損傷相關分子模式通過模式識別受體(如Toll樣受體、清道夫受體)激活庫普弗細胞，激活的庫普弗細胞即從免疫耐受狀態轉化為具有免疫活性的表型，從循環中招募中性粒細胞和炎性單核細胞，分泌多種促炎性細胞因子導致組織損傷[11-12]。其中，庫普弗細胞對抗免疫反應耗竭后可通過骨髓單核細胞再生[13]。因此，肝巨噬細胞在HIRI中具有促炎和抗炎的雙重作用。

2.1.2HO-1調控巨噬細胞分化為抗炎表型 HIRI時激活的庫普弗細胞可以極化為促炎M1型和抗炎M2型兩種亞型，而HO-1的表達促進巨噬細胞沿抗炎途徑即支持M2表型來保護HIRI。在肝臟缺血再灌注模型中，骨髓特異性HO-1基因敲除小鼠表現為M1標志物增加而M2標志物減少的表達模式，HO-1轉基因小鼠則呈相反趨勢，并減輕肝臟炎癥細胞浸潤和損傷，說明HO-1過表達驅動巨噬細胞向M2型分化[14]。其機制可能與Nrf2有關，Nrf2是抗氧化應激和抗炎的關鍵調節因子，肝臟缺血再灌注應激能增加Nrf2活性，促使Nrf2轉移至細胞核與HO-1基因啟動子上游的順式抗氧化反應元件結合，上調HO-1的表達，并促進巨噬細胞向M2型分化，減輕氧化應激介導的炎癥，改善小鼠的HIRI[15-16]。沉默信息調節因子1(silent information regulator 1,SIRT1)/p53信號通路也可能是HIRI中巨噬細胞HO-1發揮抗炎功能的基礎，HO-1可促進SIRT1的表達，從而保護p53免受泛素化，增強p53信號通路以抑制巨噬細胞的激活，減少促炎性細胞因子的釋放，同時促進抗炎性細胞因子白細胞介素-10和轉化生長因子-β產生，減輕肝臟的炎癥反應[9]。此外，HO-1的產物一氧化碳能通過穩定缺氧誘導因子-1α上調轉化生長因子-β，介導巨噬細胞抗炎表型的產生[17]。由此認為，HO-1活性是調控巨噬細胞分化和抑制“炎癥”巨噬細胞群所必需的。

2.1.3髓系HO-1介導的自噬、抗凋亡作用 在人類原位肝移植中，骨髓源性巨噬細胞產生的HO-1可協調肝細胞產生SIRT1介導自噬[18]。自噬是對損傷的一種適應性細胞應激反應，當細胞受到應激如缺血缺氧時自噬被激活，從而降解清除受損或功能異常的細胞器以維持細胞穩態，巨噬細胞HO-1通過SIRT1調控肝細胞自噬的具體機制尚不清楚，可能通過SIRT1/p38信號通路激活AMP活化的蛋白激酶磷酸化，從而促進HO-1調控自噬[9,19]。另一方面，作為肝臟HO-1的主要來源，巨噬細胞也適合作為HO-1基因轉移的細胞傳遞系統，在HIRI時HO-1轉染的骨髓源性巨噬細胞會優先遷移到缺血組織，顯著增加缺血肝臟的HO-1、上調抗凋亡因子Bcl-2的表達并抑制胱天蛋白酶3的活性，從而抑制肝細胞和LSEC凋亡，減輕肝臟損傷[20]。

因此，巨噬細胞表達的HO-1對HIRI具有重要保護作用，是抗炎、抗凋亡、誘導自噬的主要介質，HO-1轉染的骨髓源性巨噬細胞傳遞系統能在缺血再灌注應激肝臟中發揮靶向治療基因的作用。HO-1針對巨噬細胞的治療策略旨在調節庫普弗細胞激活和調控巨噬細胞極化，未來肝移植受者可以在術前或術后使用藥物誘導HO-1表達，或在體外進行基因操作使HO-1過表達，也可通過輸注外源性“抗炎”巨噬細胞群以減輕HIRI。

2.2HO-1對LSEC的保護機制

2.2.1LSEC與HIRI LSEC分布于紅細胞和肝實質細胞之間的肝竇毛細血管內皮上，具有不連續結構(即“窗孔”區域)，LSEC在調節肝血竇血流、清除廢物、細胞因子分泌和呈遞抗原方面發揮重要作用[21]。以往研究主要強調LSEC對慢性肝病中肝纖維化的作用機制，近年研究發現LSEC與HIRI早期微血管功能障礙密切相關，受損后的LSEC分泌一氧化氮減少，內皮素表達增加，一氧化氮/內皮素表達平衡失調，導致血管舒張和收縮功能受損，激活LSEC表達血管黏附因子和P選擇素，促進血小板黏附于LSEC，進一步誘導LSEC凋亡，并且再灌注后血流的機械牽拉誘導LSEC釋放趨化因子，招募中性粒細胞，而中性粒細胞與血小板的相互作用可形成中性粒細胞外誘捕網，上述微環境的改變共同引起肝微循環充血和血栓形成[22-23]，且LSEC對再灌注后的應激反應比庫普弗細胞和肝細胞更敏感，被作為早期HIRI的觀察靶點[24]。因此，早期LSEC結構與功能的改變是構成HIRI的病理生理基礎，正常的LSEC功能對于保護HIRI非常重要。

2.2.2HO-1有助于維持正常的LSEC表型 LSEC“窗孔”的維持主要依賴于自身分泌的一氧化氮，這種LSEC血管內分泌保護效應的機制與Krüppel樣因子2(Krüppel-like factor 2，KLF2)有關，KLF2是肝臟血管內皮表達的一種血管內皮保護因子，血流剪切力是刺激KLF2表達的重要因素[25]。大鼠肝移植手術阻斷肝血流時，KLF2及其靶基因內皮型一氧化氮合酶和HO-1的表達減少，再灌注時，血流剪切力刺激KLF2過表達，促使Nrf2的核易位，KLF2通過Nrf2/HO-1通路抑制內皮細胞中的內皮型一氧化氮合酶解偶聯，從而產生一氧化氮，以維持LSEC表型[26-27]。KLF2還能通過HO-1介導的自噬增加急性肝損傷早期LSEC的自噬通量，自噬可以通過去除氧化物質控制LSEC中的抗氧化反應，從而改善受損LSEC的細胞活力并增加一氧化氮水平，防止肝損傷進展[28]。由此，HO-1可作為一種中間物質促進一氧化氮的產生，從而維持正常的LSEC表型。

2.2.3HO-1改善肝竇內微循環障礙 HO-1改善HIRI后的肝竇內微循環障礙的作用機制主要是減少LSEC凋亡、抑制肝竇內LSEC與血小板黏附、抑制血小板聚集。Qu等[29]提出了HO-1在HIRI期間對LSEC的保護作用，用HO-1腺病毒感染體外培養的小鼠LSEC，發現過表達HO-1可以抑制促炎因子釋放，并通過減少LSEC凋亡顯著提高其存活率，HO-1轉染的骨髓間充質干細胞釋放的外泌體也能有效減少炎癥損傷所致的LSEC凋亡[30]。HO-1還能強化骨髓間充質干細胞的功能，促進其分化為內皮細胞，進一步加強LSEC增殖，HO-1通過LSEC調節一氧化氮/內皮素平衡降低肝竇內血管阻力，從而改善肝移植后大鼠肝竇微循環，保護和修復移植后肝臟[31-32]。另一方面，HO-1過表達還可減少HIRI中血小板與LSEC、庫普弗細胞之間的黏附，HO-1的產物一氧化碳也具有舒張血管和抑制血小板聚集的作用，血小板聚集是一個需要能量的過程，一氧化碳通過抑制血小板中ATP生成的兩條主要途徑，即抑制線粒體呼吸中的細胞色素C氧化酶和糖酵解中的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸耗竭，同時損害血小板生物能，從而有效抑制血小板聚集、增加血小板在肝竇內的流速，改善受損肝臟的肝功能和微循環障礙[33-34]。

因此，過表達HO-1可調節HIRI的微循環障礙，如維持LSEC表型、減少血小板黏附，從而改善再灌注后肝竇的血流流速等。目前HO-1對LSEC的作用機制研究較少，而保護LSEC免受損傷的治療策略是減輕HIRI的關鍵之一，通過HO-1來靶向保護LSEC可能是未來的研究方向。

2.3HO-1對肝細胞的保護機制

2.3.1肝細胞與HIRI 肝細胞是肝臟的中心代謝功能細胞，大多數肝臟特異性功能(如脂質代謝、血漿蛋白合成和解毒)主要由肝細胞執行。在肝臟缺血再灌注期間，肝細胞的呼吸鏈由于缺氧、營養物質輸送受損和ATP耗竭而中斷，細胞呼吸鏈的破壞導致線粒體功能障礙，肝細胞受損。再灌注過程中，肝組織再氧合并不會恢復細胞正常的呼吸鏈功能，而是在線粒體功能受損和肝細胞損傷相關分子模式釋放的基礎上加劇活性氧的產生，從而激活炎癥級聯反應，導致肝細胞再次受損[35]。在肝移植手術中，已通過低溫保存移植肝(即冷缺血)來減少其代謝過程中ATP的正常需求，對肝細胞具有保護作用，肝細胞在冷缺血期可能不受影響，但在再灌注期會出現大量的肝細胞凋亡[24]，這些壞死的肝細胞可能進一步引起微循環障礙，形成惡性循環，肝組織缺血性凝固性壞死，最終導致肝衰竭，故探索對肝細胞的特異性保護機制尤為必要。

2.3.2HO-1減輕肝細胞氧化應激 HIRI中肝細胞受損的主要原因之一是活性氧過量產生，導致氧化/抗氧化穩態失衡，而HO-1在肝細胞氧化應激過程中起重要作用。Brahma相關基因1是染色質重構的主要因子，參與保護氧化應激誘導的DNA損傷和調節氧化還原穩態。氧化應激時Nrf2與Brahma相關基因1相互作用促進Z-DNA即左手雙螺旋DNA形成，隨后Z-DNA招募RNA聚合酶Ⅱ到HO-1啟動子，在HO-1啟動子上形成Brahma相關基因1/Nrf2復合物，Brahma相關基因1顯著增加Nrf2與HO-1啟動子之間的募集，激活抗氧化酶HO-1基因在肝細胞中的轉錄，從而提高HO-1的轉錄效率，有效減輕肝臟氧化應激所致的肝細胞損傷[36-37]。近年研究發現，天麻素預處理能通過p38 MAPK/Nrf2/HO-1信號通路改善氧化應激和炎癥反應，防止肝細胞凋亡，從而減輕HIRI[38]。

2.3.3HO-1介導肝細胞自噬 自噬在肝細胞線粒體穩態過程中起重要作用，自噬的激活作為一種保護性手段可防止肝細胞早期凋亡變化。在HIRI早期階段，HO-1可增強受損肝細胞線粒體自噬，減少線粒體DNA釋放活性氧，減輕損傷相關分子模式誘導的炎癥反應和隨后的二次損傷。Liu等[39]發現黃芩素預處理可減輕大鼠肝細胞的缺血再灌注損傷，其保護作用依賴于HO-1介導的自噬。HO-1能通過PI3K/Akt信號通路和p38/MAPK信號通路促進Beclin-1形成，Beclin-1是一種自噬相關蛋白，參與早期階段的自噬體形成，HO-1誘導使自噬相關蛋白微管相關蛋白1輕鏈3和Beclin-1的水平顯著提高，從而促進肝細胞自噬，吞噬受損線粒體，抑制肝細胞凋亡[40-41]。自噬阻止細胞凋亡的機制可能與Beclin-1的C端有關，Beclin-1的C端可以放大線粒體介導的細胞凋亡作用[42]。此外，肝細胞內鈣超載和鈣蛋白酶系統激活可能是HIRI中自噬受損的主要原因，HO-1誘導的自噬還可以通過抑制鈣依賴性鈣蛋白酶2信號通路來調控，在缺血再灌注前用HO-1誘導劑預處理能以濃度依賴的方式降低肝細胞內鈣蛋白酶2水平，且HO-1處理的肝組織顯示大量的自噬空泡，出現了選擇性的線粒體自噬，使受損的線粒體被清除[43-44]。因此，HO-1通過誘導肝細胞自噬介導了強大的細胞保護作用。

2.3.4HO-1抑制肝細胞凋亡 HO-1具有抗肝細胞凋亡作用的主要機制在于激活核因子κB和調控凋亡蛋白。有研究證明，低水平的活性氧可以觸發細胞適應性反應和生存，PI3K/Akt通路的激活也被認為是活性氧信號通路觸發的自適應信號通路[45]。HO-1的產物一氧化碳能產生低水平的活性氧，使Akt磷酸化，活性氧信號通路和Akt磷酸化共同促進核因子κB的激活，以阻止肝細胞凋亡[46]。另一方面，肝細胞受損后促凋亡蛋白Bcl-2相關X蛋白會易位至線粒體，導致胱天蛋白酶3活化引起線粒體凋亡，而一氧化碳可通過激活p38 MAPK通路抑制Bcl-2相關X蛋白向線粒體轉運，并提高抗凋亡分子(如Bcl-xL、Bcl-2)的表達，從而抑制肝細胞凋亡[47]。

綜上，HO-1及其產物一氧化碳可通過不同機制對肝細胞提供抗氧化應激、促進自噬、抗凋亡的細胞保護作用。近年研究發現，人類抗原R能作為HO-1的調節劑，通過自噬穩定HO-1的信使RNA，在人類肝移植中發揮肝細胞保護作用[48]。大鼠腸道短暫性缺血預處理也能在肝細胞中誘導大量HO-1，為之后的HIRI提供保護作用[49]。因此，給予HO-1誘導劑、人類抗原R、無毒濃度的一氧化碳等治療措施可能從多方面改善肝臟疾病的發展，促進HIRI后患者的快速恢復。

3 小 結

HIRI是一個涉及多細胞、多分子、多信號通路的復雜過程，隨著研究的逐漸深入，明確調節基因與精準靶向細胞尤為重要。近年來，納米藥物傳遞系統已被用于生物醫學，通過設計納米顆粒的大小、所帶電荷及特定配體，有助于識別肝臟細胞上的細胞靶標或其受體，可在所需肝臟缺血再灌注損傷區域將HO-1抗炎及抗氧化藥物靶向遞送和可控釋放[50]，實現細胞選擇性給藥，并增加藥物療效和安全性。因此，基于HO-1基因的靶向細胞療法與納米技術相結合的治療策略可能成為未來治療肝損傷的一種新方式，對改善實體器官移植具有很大潛力。