Keap1/Nrf2信號通路與神經退行性疾病的研究進展

許莉莉，高雅然，呂佩源,

(1.河北北方學院研究生院，河北 張家口 075000； 2.河北醫科大學神經病學教研室，石家莊 050017；3.河北省人民醫院神經內科，石家莊 050051)

神經退行性疾病是指一類慢性、不可逆性、進行性的以神經元退行性病變為基礎的疾病，主要包括阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)、帕金森病(Parkinson′s disease，PD)、肌萎縮性側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、亨廷頓病(Huntington disease，HD)等，其病因和發病機制十分復雜，主要發病機制可能與氧化應激密切相關[1]。氧化應激是自由基及活性代謝物或活性氧的產生與通過保護機制(如抗氧化酶、抗氧化劑)消除之間的不平衡，這種不平衡可以導致細胞、組織和器官損傷，是各種病理過程的主要指征之一。核轉錄因子紅系2相關因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是抗氧化防御關鍵因子，可增強抗氧化反應對氧化應激的表達。研究發現，腦內氧化應激增強時伴隨Nrf2的表達減少，在各種神經退行性疾病中均起保護作用[2]，推測Nrf2可能是針對神經退行性疾病的潛在治療靶點，但尚缺乏針對該病治療的臨床研究，且療效不滿意，迫切需要尋求新的有效的神經退行性疾病治療方法。由于Nrf2可能控制、調節和維持解毒以及抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)的表達，其激活在氧化應激與神經退行性疾病的病理中起著關鍵作用[3]?，F就Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1)/Nrf2信號通路與相關神經退行性疾病的相關性予以綜述，以期為相關疾病的早期發現和預防提供幫助。

1 Keap1/Nrf2信號通路

Keap1/Nrf2信號通路介導的抗氧化防御系統是保護機體免受氧化應激的主要機制，該通路可以調節抗氧化劑的轉錄，從而保持機體內環境的穩定。Nrf2由NFE2L2基因編碼，屬于轉錄因子CNC家族，含有605個氨基酸，包含一段含有高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結構，分布于不同組織和器官，并同時表達于不同類型細胞。通過核磁共振波譜和高分辨率晶體結構進行結構域的分析表明，Nrf2分子結構中含有7個Nrf2-ECH的同源(Nrf2-ECH homologous，Neh)功能結構域(Neh1～7)，它們主要參與調節該物質的轉錄活性及穩定性。Neh1是第一個保守結構域，包含3個堿性亮氨酸拉鏈基序，允許Nrf2與ARE序列結合。在Nrf2從Keap1釋放后，Neh1結構域暴露Nrf2所需的核定位信號，從而轉移到細胞核中；此外，該結構域還可與E2泛素結合酶UbcM2相互作用調節Nrf2蛋白穩定性。Neh1和Neh2在Nrf2調節方面發揮不同的作用，Neh2是位于N端的負調節結構域，可促進Nrf2泛素化，隨后蛋白酶體降解，這是Keap1-Nrf2結合增強的結果。Neh3結構域位于C端，可調節ARE基因的轉錄激活。Neh4及Neh5屬于轉錄激活結構域，可與共激活cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)結合，從而促進Nrf2轉錄，并通過與核激素受體轉錄共激活因子AIB1相互作用增強Nrf2-ARE基因的表達。Neh6和Neh7結構域是Nrf2活性的負調節因子，Neh6結構域Nrf2的非Keap1依賴性降解是β-轉導素重復蛋白的結合點。Neh7結構域通過與視黃酸X受體α相互作用，抑制Nrf2表達[3-4]。

Keap1含有624個氨基酸，作為Cullin-Ring E3泛素連接酶多亞基蛋白復合物的組成部分，是細胞內Nrf2的主要調控因子。Keap1作為KLHL家族成員，由N端區域、BTB結構域、C端Kelch結構域(又稱IVR區域)組成。其中，BTB結構域是蛋白質-蛋白質相互作用的結構域，在體外形成異構體和同源二聚體，與Nrf2-Keap1的結合力相關；Kelch結構域位于Keap1的C端，由6個Kelch重復序列組成，是Keap1-Nrf2的結合位點。Kelch結構域與Nrf2蛋白中的兩個基序結合，分別稱為ETGE基序(起“鉸鏈”作用)和DLG基序(起“閂鎖”作用)，被泛素-蛋白酶體降解，從而維持Nrf2的穩定表達。但是暴露在親電試劑或活性氧條件下，Keap1中的半胱氨酸殘基被修飾，引起多泛素的停止?！般q鏈”和“閂鎖”的相互作用可以降低Keap1對Nrf2的親和力，但不會導致釋放[5],而新合成的Nrf2被轉移到細胞核，可觸發Nrf2依賴基因的轉錄，從而提高細胞抗氧化應激防御能力[6]。

在正常生理條件下，Nrf2通過ETGE和DLG基序與Keap1結合，激活Cullin3的E3連接酶復合物與Nrf2泛素化，隨后蛋白酶體降解[7]。在氧化應激條件下，Nrf2從Keap1分離并轉移到細胞核，并與小Maf(肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物)蛋白異二聚體化。ARE是Nrf2靶基因調控區的增強子序列，異二聚體通過識別ARE發揮調控轉錄因子的作用[3]。故Nrf2/ARE信號通路在調控參與活性氧解毒和細胞毒性中起關鍵作用。

2 Keap1/Nrf2信號通路與神經退行性疾病

活性氧的積累是導致神經退行性疾病的主要機制，若維持活性氧生成和消耗的平衡被破壞可能導致大腦穩態喪失，進而導致神經退行性疾病。目前，已在神經退行性疾病患者中檢出氧化標志物水平升高以及細胞成分的破壞，Keap1/Nrf2信號通路與神經退行性疾病的發生和進展存在復雜聯系，該類疾病的共同特征之一是氧化還原代謝的受損，可導致活性氧積累，影響蛋白質的結構。因此，干預Keap1/Nrf2信號通路的靶點可能為抗氧化應激提供機會，并可能預防或延緩疾病進展。

2.1Keap1/Nrf2信號通路與AD AD是一種進行性神經退行性疾病，主要表現為認知下降和記憶功能障礙，其病理學標志是來自淀粉樣斑塊和腦內淀粉樣血管病的β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)以及異常磷酸化tau蛋白形成的神經原纖維纏結[8]，主要表現為認知功能減退和非認知性神經精神癥狀。AD早期階段可出現氧化應激導致的損傷，標志物主要為蛋白質、脂質、核酸的氧化損傷。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶是大腦中活性氧的主要來源，其激活介導的氧化應激造成的損傷與AD中Aβ及tau病理機制相關[9]。

隨著AD患者及健康老年人年齡的增加，Nrf2水平均降低，Nrf2在維持神經元線粒體功能、突觸可塑性和衰老過程的認知功能中起著重要作用。Keap1是改善AD中Nrf2缺陷和保護神經元免受損傷的有效靶點，使用Nrf2抑制劑可有效保護小鼠神經元培養物免受天然來源Aβ寡聚體的突觸毒性[10]。另有研究證實，miR-592通過激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路，降低C-Keap1表達，增強Nrf2和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸:醌氧化還原酶1的表達，提高細胞活力，從而保護星形膠質細胞免受氧化應激的損傷[11]。

AD的病理改變主要為Aβ和異常磷酸化tau蛋白形成的神經原纖維纏結。硫胺素(維生素B1)在腦能量代謝中起著重要作用，其缺乏與癡呆的嚴重程度存在一定關系，苯二胺是一種合成的S-硫胺素的?；苌?，該物質及其代謝產物在細胞和動物水平是Nrf2的激活劑，可顯著增加Nrf2依賴基因的表達，具有抗tau蛋白磷酸化和神經原纖維纏結的神經保護作用，長期使用苯二胺可有效改善認知障礙、延長壽命、防止運動神經元的死亡[12]。同時，Aβ在AD的發病機制中起著關鍵作用。采用Aβ25～35誘導的PC12細胞氧化損傷模型在激活Keap1/Nrf2信號通路后，血紅素加氧酶-1和其他抗氧化酶[如超氧化物歧化酶(superoxide dismutas，SOD)、過氧化氫酶]的表達水平升高，表明Keap1/Nrf2信號通路的激活在預防或修復神經損傷方面發揮保護作用[13]。在動物以及細胞水平，激活Nrf2具有顯著的抗Aβ作用以及由大腦中增強的磷酸化tau蛋白誘導的神經原纖維纏結毒性作用，可調節氧化應激酶水平、改善與記憶和認知相關的病理行為，從而有效治療AD[14]。已有研究證實，Keap1/Nrf2信號通路的激活與AD密切相關[15]，可能是治療AD的靶點，且可預防或改善AD，但目前還缺乏關于其臨床應用的安全性和有效性研究。

2.2Keap1/Nrf2信號通路與PD PD是繼AD后第二大常見的神經退行性疾病，其主要特征是位于黑質的多巴胺神經元丟失導致的多巴胺水平降低，主要臨床表現包括靜止震顫、肌肉僵直和運動遲緩。PD患者的大腦中存在生化和細胞異常，包括線粒體功能障礙、自由基導致的損傷、興奮毒性和炎癥等變化，其中氧化應激起關鍵作用。Bhattacharyya等[16]報道，血清尿酸鹽水平越高，PD進展越慢，抗氧化藥物可改善機體的抗氧化能力，因此抗氧化藥物對PD患者具有潛在益處。PD中氧化應激指標(如丙二醛、乳酸脫氫酶)水平明顯升高，而總SOD、谷胱甘肽過氧化物酶、血紅素加氧酶-1、Nrf2蛋白表達明顯減少[17]，推測激活Nrf2通路可以減緩氧化應激導致的損傷，從而保護神經元。

PD以蛋白質病和線粒體功能障礙為特征，大多數為病因不明的散發型和少數家族性，其病理機制為氧化應激的增加。激活Keap1/Nrf2通路可延緩PD患者的神經退行性病變進展[18]。體外研究顯示，不同PD相關藥物對PD模型多巴胺神經元具有保護作用，其中茶多酚通過抑制多巴胺氧化、結合、清除活性氧，調節Keap1/Nrf2抗氧化信號通路，進而保護多巴胺相關毒性[19]。Rizzi等[20]采用一種成像的方法發現，在小鼠大腦的黑質致密部區域Nrf2激活早于多巴胺能神經變性。體內外研究均證明，上調Nrf2以及通過Nrf2調節其他基因和蛋白質水平，可以減輕機體氧化應激和炎癥，起到神經保護作用[21]。因此，Nrf2的激活可能是PD神經退行性病變的關鍵靶點，可為預防多巴胺能神經退行性病變和運動缺陷提供幫助。

Lastres-Becker等[22]利用α-突觸病模型對野生型小鼠與Nrf2-/-小鼠進行的對照實驗證實，Nrf2缺乏可加重PD早期的蛋白質聚集、自噬、神經元死亡和炎癥反應，在細胞和動物水平上，利用富馬酸二甲酯靶向Nrf2作為一種治療策略，可通過激活Nrf2通路增強內源性腦防御機制，對抗PD相關的突觸核蛋白病，從而發揮多巴胺能神經元保護作用。而另一項研究報告顯示，Nrf2基因表達水平與rs35652124基因型、PD或發病年齡無關[23]。PD腦中多巴胺能神經元的進行性退化導致黑質多巴胺水平急劇下降，引發PD臨床癥狀，其中氧化應激起關鍵作用，但目前尚無緩解PD進行性多巴胺神經元變性的特異性藥物，Nrf2與PD發病機制的關系仍存在爭議。

2.3Keap1/Nrf2信號通路與HD HD是一種常染色體顯性遺傳病，主要病理特征是突變的亨廷頓蛋白在胞質聚集，導致活性氧產生增多，誘導細胞毒性增加，損害神經，臨床表現為運動和認知障礙、人格改變和精神障礙。對體外細胞(木犀草衍生物C6處理的HD細胞)的研究闡明，活性氧水平的降低主要與Nrf2磷酸化和Nrf2/ARE核轉錄活性的增強、SOD1基因和SOD活性的增加以及谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基基因和蛋白水平的升高有關[24]。在HD小鼠模型和HD患者中，一種含苯三唑的Nrf2誘導劑在激活Nrf2信號通路后與ARE結合，導致活性氧的生成顯著減少[25]，故推測氧化應激中的Keap1/Nrf2信號通路在其中起著關鍵作用。

激活Nrf2/ARE通路以及應用膳食抗氧化劑化合物同時提高抗氧化酶的水平，可有效降低氧化應激、慢性炎癥和谷氨酸的釋放，延緩HD癥狀的出現[26]。通過設計和測試幾種環肽發現，Keap1/Nrf2質子泵抑制劑可能有效治療HD，這為臨床治療提供了重要見解[27]。激活Nrf2及下游基因可有效提供HD紋狀體細胞中的抗氧化能力，證實Nrf2通路對HD細胞氧化應激的神經保護作用[28]。由于Nrf2信號對下游成分的調控，激活Nrf2在成年動物中可發揮抗氧化作用，但在老年動物中可增加機體損害[29]。此外，人參皂苷是一種人參衍生的溶血磷脂酸受體配體，可在HD體外(細胞)和體內(AAV載體感染的HD小鼠模型)通過聯合或協同機制激活脫脂轉化酶和Keap1/Nrf2信號通路，為HD的臨床治療提供了證據[30]。Moretti等[31]證明，激活Keap1/Nrf2通路可以保留細胞中的ATP含量和線粒體電位，以保護星形膠質細胞免受氧化應激的損傷，證實內源性抗氧化劑不受HD中樞神經系統組織中亨廷頓蛋白的損害，這為HD的治療提供了可靠依據。由此可見，氧化應激的增加和慢性炎癥是HD發病機制中的早期事件，但目前尚無有效手段來阻止或推遲HD癥狀的出現。

2.4Keap1/Nrf2信號通路與ALS ALS是一種進行性神經退行性疾病，其特征是脊髓前角和運動皮質的神經運動元的進行性喪失，導致骨骼肌萎縮、無力以及癱瘓。氧化應激升高是ALS腦和脊髓的主要病理過程，不均一核糖核蛋白K與編碼Nrf2抗氧化轉錄因子的抗氧化NFE2L2轉錄物結合，導致Nrf2信號的下游抗氧化轉錄物表達增加[32]。利用蛋白質結構模型的研究已闡明，Keap1/Nrf2信號通路在抗氧化應激反應的調節中起關鍵作用[33]?？梢?，Keap1/Nrf2信號調節的氧化應激與ALS發病機制有關，干預Keap1/Nrf2信號通路的靶點可能是預防或治療ALS的關鍵。

ALS發病機制仍不明確，約90%的病例為散發，10%為家族性；在家族性病例中，20%由SOD1基因的點突變引起。給予SOD1 G93A ALS小鼠模型清除自由基的藥物通過Nrf2途徑激活線粒體抗氧化活性，并降低SOD1表達和活性氧水平，改善運動性能，減少脊髓運動神經元損失和相關的神經膠質反應[34]。在體外(突變人SOD1的NSC-34細胞)和體內(果蠅ALS模型)使用內源性抗氧化劑可以減少活性氧的產生，刺激Nrf2的激活可導致谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基的表達和谷胱甘肽的合成增加，可作為治療ALS的臨床候選藥物[35]。Zhang等[36]證實，抗氧化劑可通過激活Nrf2/谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基通路改善運動缺陷，調節氧化還原穩態。綜上，氧化應激是ALS的主要病理過程，但仍需研究評估Keap1/Nrf2信號通路對細胞蛋白酶抑制以及其他ALS相關基因突變的影響，以及激活Nrf2對預防氧化應激的影響。

3 小 結

近年來，氧化應激在多種疾病中發揮重要作用。Nrf2是抗氧化防御系統的關鍵因子，同時參與抗炎、抗衰老、改善糖脂代謝紊亂、線粒體功能等過程。在AD、PD、HD及ALS等神經退行性疾病的治療中，激活Keap1/Nrf2通路具有神經保護作用，但該通路的縱向研究尚缺乏針對疾病表現的治療，且相關細節尚不清楚，需進一步研究和探討Keap1/Nrf2通路在神經退行性疾病發病過程中的作用，深入了解該通路在神經退行性疾病中的作用及作用機制，以期為疾病的預防和治療提供新的方法和思路。