川崎病急性期相關的生物標志物研究進展

吳玉秀，張永峰

(濰坊醫學院附屬醫院兒科，山東 濰坊 261000)

川崎病是一種主要發生在5歲以下兒童的急性、自限性、發熱性血管炎。1967年日本川崎富作(Tomisaku Kawasaki)博士首先報道該病，并將其命名為川崎病[1-2]。川崎病的發病率、死亡率、臨床表現、冠狀動脈損傷情況、預后等存在地域和種族差異，目前對于該病的認知還十分淺顯。川崎病的臨床特征與許多兒童時期的傳染性疾病(麻疹、猩紅熱、腺病毒感染等)相似，均有發熱、皮疹、口腔黏膜彌漫充血、淋巴結腫大以及炎癥指標升高等表現。對于川崎病患兒，尤其是不完全川崎病患兒，如不能及時早期診治，約25%的川崎病患兒會發生冠狀動脈病變，這會嚴重影響患兒的預后。

川崎病病程分為急性期、亞急性期和恢復期，其中急性期的特征是壞死性血管炎，以中性粒細胞和巨噬細胞浸潤為主，炎癥標志物升高[3]，但炎癥標志物是非特異性的，在其他炎癥和感染性疾病中也會升高。在川崎病的診療過程中，盡管炎癥性生物標志物提示機體正在發生的炎癥反應，但在確定性診斷中的價值有限。與其他血管炎性疾病和風濕病不同，川崎病沒有可以明確診斷的特異性實驗室指標、病理指標等。因而，在川崎病急性期發現與川崎病相關的生物標志物，可為川崎病早期診斷、預測疾病進程、免疫球蛋白耐藥及冠狀動脈后遺癥傾向提供參考?，F從基因、蛋白、免疫、血漿4個方面對川崎病急性期相關生物標志物予以綜述，以便早期識別川崎病，更好地指導臨床工作。

1 基因標志物

川崎病在亞裔人群中的發病率明顯高于白種人群，這可能由生活環境或生活方式的差異導致，但也有可能由遺傳易感性導致[4]。在夏威夷定居的日裔中，川崎病的發病率也較高，并與日本本土人的發病率相似[5]，提示該病可能與遺傳有關。運用候選基因方法和全基因組關聯研究方法，在疾病急性期識別易感基因可為川崎病的早期診斷提供幫助，同時也為尋找新的藥物靶點提供依據。

1.1B淋巴酪氨酸激酶(B lymphoid tyrosine kinase,BLK)基因 BLK基因編碼B細胞上的類固醇受體共激活子家族的B淋巴酪氨酸激酶，其在信號轉導通路下游的幾個基因中起作用。BLK基因參與了免疫球蛋白A和免疫球蛋白B的免疫受體酪氨酸激活基序殘基的磷酸化，且BLK基因的突變會導致胰腺B細胞功能異常，從而導致川崎病患兒內環境紊亂[6]。Lee等[7]發現，BLK在B細胞的信號轉導中發揮作用。在川崎病急性期，B細胞中的rs2736340風險等位基因參與了BLK的低表達，影響了川崎病患者B細胞的功能，增加了川崎病的易感性。此外，川崎病急性期，丙種球蛋白給藥前，BLK信使RNA的表達較高，但丙種球蛋白給藥后BLK信使RNA的表達降低，恢復期進一步降低[8]。以上研究表明，在未給予任何藥物干預之前，川崎病急性期患兒體內BLA信使RNA高表達。BLK基因突變使得其信使RNA表達異常、B細胞功能異常，導致川崎病患兒機體代謝紊亂，增加了川崎病的基因易感性。

1.2鈣釋放激活鈣通道調節分子1(calcium release-activated calcium channel modulator 1,ORAI1) 基因 ORAI1是一種涉及T細胞調節和炎癥反應的鈣離子通道蛋白。Onouchi等[9]發現，日本人群中ORAI1基因第2外顯子的單核苷酸多態性(rs3741596)與川崎病具有顯著的非同義關聯，并伴有川崎病高風險，單核苷酸多態性會導致ORAI1的第2個胞外環中第218位的氨基酸從絲氨酸轉變為甘氨酸。在后繼的研究中發現，日本人群中ORAI1(rs3741596)風險等位基因頻率是歐洲人的20倍，同時ORAI1基因的變異體(rs141919534)也與川崎病密切相關[10]。據報道，ORAI1基因編碼的蛋白質與川崎病的易感性相關，ORAI1基因變異體影響了ORAI1基因相關蛋白質的合成與加工，進而影響了ORAI1基因編碼的蛋白質，增加了川崎病的易感性[11]。以上研究表明，通過基因檢測技術檢測與川崎病易感性相關的基因及其變異體，可在急性期及時發現并識別川崎病，為川崎病的治療提供幫助。

1.3胱天蛋白酶3基因 胱天蛋白酶3基因位于第4號染色體，編碼胱天蛋白酶3，其是活化誘導細胞死亡的重要分子。Onouchi等[12]報道，胱天蛋白酶3基因表達的改變影響免疫效應細胞對川崎病的敏感性。研究顯示，胱天蛋白酶3基因5′非翻譯區的單核苷酸多態性(rs72689236)會增加歐美人群和日本人群川崎病的發生風險，在胱天蛋白酶3基因中發現的多種變異體(rs2702038、rs72689236及rs113420705)與川崎病顯著關聯[12-13]。此外，Wang等[14]研究表明，Ca2+/活化T細胞核因子信號中的多種遺傳變異均與中國人川崎病發生風險相關，不同變體[CASP3 rs2720378、白細胞介素(interleukin，IL)-2 rs2068962和基質相互作用分子1 rs1561876]也可通過協同作用增加罹患川崎病的風險。

綜上所述，通過遺傳學方法鑒定出川崎病急性期易感基因，基于這些基因制訂臨床標準將改善川崎病的診斷靈敏度，有助于及早治療和預防冠狀動脈損傷。

2 蛋白標志物

隨著質譜法蛋白質組學分析研究的出現，與川崎病相關的蛋白生物標志物研究取得了顯著進展，盡管先前的研究希望通過基因表達早期診斷川崎病，但基于蛋白質的發現可能更容易轉化為具有臨床實用性的檢測方法，從而幫助兒科臨床醫師在疾病急性期識別川崎病。

2.1N端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriunetic peptide,NT-proBNP) NT-proBNP是目前研究較多的一種蛋白，主要影響心臟功能，其水平升高提示心臟容量負荷過重，心功能不全。NT-proBNP在川崎病急性期也升高，可作為川崎病急性期的生物標志物。楊芳等[15]依據患兒入院時的病程(主要分為≤7 d，8～11 d，12～21 d)、NT-proBNP的水平(截點值為300 ng/L)以及心動圖檢測的冠狀動脈情況，對川崎病患兒(包括154例典型川崎病和102例不完全川崎病)進行比較發現，病程早期(病程≤7 d)，NT-proBNP≥300 ng/L的患兒冠狀動脈損害發生率明顯升高。Lin等[16]的Meta分析顯示，NT-proBNP的截點值為96～260 ng/L時診斷川崎病的靈敏度為66%～98%。Reddy等[17]的研究也報道了NT-proBNP的截點值為125 ng/L時，診斷川崎病急性期的靈敏度為88%，特異度為96%。以上研究表明，川崎病急性期NT-proBNP的水平可升高，對NT-proBNP的截點值進行研究有望幫助兒科醫師在疾病急性期明確診斷并進行針對性治療。

2.2半乳糖凝集素3(galectin 3，Gal-3) Gal-3是由活化的巨噬細胞分泌的一種β半乳糖凝集素，常被用作心力衰竭的潛在生物標志物。川崎病急性期患兒體內的Gal-3水平有不同程度的升高。Hoshino等[18]的研究在矯正川崎病患兒的性別和年齡后發現，射血分數正常的川崎病患兒體內的Gal-3水平較急性期射血分數減低史川崎病患兒低。在后繼的研究中發現，盡管所有患者的射血分數在治療后恢復正常，但是Gal-3水平在初次發病后數年仍較高[19]。國內也有學者報道，川崎病患兒Gal-3水平在急性期明顯升高，并隨著病程的進展緩慢下降，通過檢測體內Gal-3水平可幫助早期識別川崎病[20]。

2.3其他蛋白標志物 研究顯示，可溶性生長刺激表達基因2蛋白、心肌肌鈣蛋白、γ-谷氨酰轉肽酶、丙氨酸轉氨酶、血小板反應蛋白-1和血小板反應蛋白-2等的水平在川崎病急性期顯著升高[21]，它們有助于為川崎病急性期相關生物標志物研究提供新方向。

Jakob等[22]采用酶聯免疫吸附試驗對23例川崎病急性期患者和5例康復期川崎病患者的血管內皮損傷標志物血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)參數(vWF:抗原和vWF:膠原蛋白結合活性)進行評估。通過計算vWF:抗原和vWF:膠原蛋白結合活性的比率以及對vWF多聚體結構進行分析發現，急性期vWF:抗原和vWF:膠原蛋白結合活性水平顯著高于恢復期，提示vWF:抗原和vWF:膠原蛋白結合活性的比率能夠早期預測川崎病的發生。Kimura等[23]使用基于質譜的蛋白質組學分析鑒定差異表達的蛋白質，研究鑒定出4種與川崎病相關的蛋白：脂多糖結合蛋白、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、血管緊張素原和視黃醇結合蛋白4,其中急性期脂多糖結合蛋白、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、血管緊張素原的水平顯著高于恢復期，但視黃醇結合蛋白4急性期的水平較恢復期低。以上兩個研究表明，對于vWF參數的全面分析可能有助于監測川崎病急性期的炎癥反應，并有助于識別冠心病風險增加的患者。在急性期檢測出高水平的脂多糖結合蛋白、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白和血管緊張素原為預測川崎病的發生提供了依據。

3 免疫標志物

3.1CD8T細胞 CD8T細胞活化后可以分化為細胞毒性T細胞，其可以抵制各種病毒的入侵以及殺滅外來的病原體。CD8T細胞及其早期活化的生物標志在川崎病急性期高表達，并與冠狀動脈損傷密切相關[24-25]。Rivas等[24]對伴有冠狀動脈損傷的川崎病患者的尸體進行檢查后發現，CD8+T細胞優先隔絕在冠狀動脈中，并引起炎癥性血管炎。不僅CD8T細胞，早期T細胞活化的標志物CD69+CD8T細胞在川崎病患兒急性期也明顯增加[25]。

3.2髓樣樹突狀細胞(myeloid dendritic cell,mDC) mDC來源于造血干細胞，主要發揮抗原呈遞作用。mDC作為獲得性免疫與固有免疫之間的橋梁，已被證實在川崎病患者中減少。在川崎病急性期，mDC的下降是受累組織的再循環或外周破壞增加所致[26]。Burns等[27]認為，只有年齡較大的兒童在整個免疫循環中有大量成熟mDC,這一特征使得川崎病患兒表現出嚴重的炎癥反應，表現為紅細胞沉降率升高，丙氨酸轉氨酶、γ-谷氨酰轉移酶水平升高，彌散性血管內凝血和心肌炎。以上研究表明，川崎病急性期炎癥反應上調可能是由于固有免疫軸存在功能障礙導致，因此mDC能夠成為早期預測川崎病的生物標志物。

3.3IL-17A IL-17A是一種主要由輔助性T細胞17產生的促炎性細胞因子，輔助性T細胞17及其產生的IL-17A通過上調其他細胞因子和基質金屬蛋白酶而發揮促炎作用[28]。血清IL-17A的水平與川崎病急性期和亞急性期病情活動呈正相關，血清IL-17A水平可指導丙種球蛋白的用藥[29-31]。Guo等[29]采集丙種球蛋白治療前24 h以及丙種球蛋白治療后3 d、21 d川崎病組患兒和發熱對照組患兒的血液樣本進行分析，結果顯示丙種球蛋白治療前24 h，川崎病組患兒的血漿IL-17A水平較發熱對照組顯著升高[(25.35±3.21) ng/L比(7.78±1.78) ng/L]，而兩組患兒的IL-17A水平在丙種球蛋白治療后3 d和21 d明顯降低，說明在川崎病急性期IL-17水平較高，IL-17A可能是川崎病早期診斷最為重要的生物標志物之一。Jia等[30]的研究也發現，川崎病患兒的IL-17A水平較高。劉欣等[31]的研究同樣證實，川崎病急性期及亞急性期血清IL-17A的水平均升高。

綜上所述，由于免疫系統紊亂，川崎病急性期產生了大量異常的免疫細胞、化學因子等，導致血管炎的形成。

4 血漿標志物

目前川崎病僅依靠臨床表現診斷，血液檢查和儀器檢查輔助診斷，但由于川崎病是由感染性因素誘發的自身免疫性疾病，因此難以區分川崎病與感染性相關疾病，尤其是兩者均伴隨發熱時。目前關于川崎病血漿標志物的研究很少將感染引起發熱的患兒設為對照組，且大多數研究均是基于單個生物標志物來預測川崎病的發生的。使用多個生物標志物聯合測定診斷川崎病較單個生物標志物測定更能早期識別川崎病，并為川崎病的早期診斷提供依據。

血漿炎癥標志物種類很多，如C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、髓樣相關蛋白8/14(myeloid-related protein 8/14,MRP8/14)、人中性粒細胞彈性蛋白酶(human neutrophil elastase,HNE)。CRP是一種急性期炎癥蛋白，其可與微生物上的多糖結合，觸發經典的補體途徑，并啟動先天性免疫應答[32]。CRP通常在急性感染和發熱期升高[33-34]。MRP8/14被認為是多種炎癥性疾病的生物標志物，包括炎性腸病和類風濕關節炎[35-37]。HNE是中性粒細胞活化的標志物。有研究報道，川崎病急性期HNE水平升高[38]。Zandstra等[32]的研究包含1個發現隊列和2個獨立驗證隊列，結果顯示，在發現隊列中，MRP8/14聯合CRP可以區分川崎病患者(n=48)與和感染發熱患者(n=105),曲線下面積為0.88；第1個驗證隊列證實了MRP8/14聯合CRP可區分急性期川崎病患者(n=26)與感染發熱患者(n=150)，曲線下面積為0.78；同樣，MRP8/14聯合CRP也可區分第2個驗證隊列的急性川崎病患者(n=25)和感染發熱患者(n=50)，曲線下面積為0.72，當包括HNE時，曲線下面積可以提高到0.84。該研究還發現，MRP8/14、CRP、HNE聯合使用時更有助于鑒別川崎病和感染發熱兒童。值得注意的是，在川崎病急性期后的1、2、3個月在患兒的血液樣本中仍有可能檢測到HNE，且發病5年以上的有冠狀動脈瘤的川崎病患兒中CRP仍然升高[33]。這表明，輕度炎癥在亞臨床的存在時間可能較以往認為的更長。綜上，MRP8/14、CRP和HNE聯合使用可能有助于區分川崎病和疑似感染。

5 小 結

在川崎病急性期尋找一些特異性較高且能充分應用于臨床的生物標志物以幫助臨床兒科醫師早期識別川崎病已成為當務之急?；驑酥疚锖兔庖邩酥疚镆蚱鋸碗s性很難應用于臨床，基于質譜法的蛋白質組學分析對于低水平的血清蛋白質標志物檢出率較低，而單個血漿標志物對川崎病預測缺少特異性和敏感性。以上提示對于川崎病急性期相關生物標志物進一步開展多中心大樣本研究的必要性，以期早期識別對川崎病敏感性和特異性較高的生物標志物。