HPLC法測定不同石竹中山奈酚三糖苷的含量

王苗苗，孫瑞芬，王均亮，李趙菊，張 婷，周旭紅*

(1. 云南中醫藥大學 中藥學院，云南 昆明 650500；2. 云南中醫藥大學 科技處科研實驗中心，云南 昆明 650500)

石竹為石竹科石竹屬植物，多年生草本。石竹屬DianthusL.植物全球約600種，廣泛分布于北溫帶，大部分產于歐洲和亞洲。我國有16種10變種，南北均產之，大多生于干燥向陽處?，F已廣泛栽培，是很好的觀賞花卉，耐瓶插，常用作切花[1]。同時石竹屬植物也具有很好的藥用價值。因此，研究其植物活性成分的含量具有重要意義，可以為石竹屬植物提供更為廣闊的市場前景。

香石竹DianthuscaryophyllusL.具有清熱利尿、破血、通便的功效，其花可用作芳香矯味劑、解痙劑、鎮靜劑[2]。在過去很長一段時間里，香石竹被用于愈合傷口，治療咽喉和牙齦感染，胃腸道疾病以及其他各種疾病。中藥瞿麥來源于石竹屬植物瞿麥DianthussuperbusL. 或石竹DianthuschinensisL. 的干燥地上部分，具有利尿通淋、活血通經的功效。用于熱淋、血淋、小便不通、經閉瘀阻等癥[3]?，F代藥理學研究表明，石竹還具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌和殺蟲等作用[4-8]。

山奈酚三糖苷是石竹的活性成分之一，屬于黃酮醇類化合物。在植物中，黃酮醇的作用是保護植物抵抗環境的各種刺激。在人體中，黃酮醇對人體的生物反應起修飾作用，具有廣泛的藥理作用。Liu等[9]研究發現山奈酚三糖苷可能對小鼠燒傷有療效。用主要含有山奈酚三糖苷成分的山茶花提取物對燒傷小鼠進行治療，可以降低促炎細胞因子的表達水平并增加膠原合成?？赡芡ㄟ^抑制 NF-κB信號通路降低 LPS刺激的人皮膚角質形成細胞中促炎細胞因子的表達水平。因此，山奈酚三糖苷是治療人類燒傷的有效、安全的潛在藥物。Shkondrov等[10]在6-羥多巴胺誘導的離體大鼠腦突觸體體外模型上發現山奈酚三糖苷具有與水飛薊素相似的神經保護活性, 具有神經退行性疾病治療作用。但目前對不同品種石竹中山奈酚三糖苷含量的分析評價研究尚少。

參考文獻[11-13]，建立合適的石竹植物中山奈酚三糖苷的含量測定方法，并使用所建HPLC法對云南省玉溪市江川區石竹種植基地采集的16種石竹以及石竹不同部位進行山奈酚三糖苷成分的含量測定，通過比較不同品種、不同部位的含量差異，為培育或采收合適的品種、植物的不同組織提供參考依據。為進一步開發利用石竹植物資源提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀(包括DAD 檢測器,美國 Agilent 公司)；電子天平EX125DZH(奧豪斯儀器有限公司)；超聲波清洗器SG3300HDT(上海冠特超聲儀器有限公司)；醫用離心機L550(湘儀離心機儀器有限公司)。

1.2 試驗材料

山奈酚三糖苷(Kaempferol-3-O-(2”-glucosyl)rutinoside)對照品(云南西力生物技術有限公司，純度≥98%)；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；磷酸、冰乙酸等化學試劑為分析純。石竹16個不同品種見圖1以及‘BRINA’花的不同發育時期見圖2，均采自云南省玉溪市江川區石竹種植基地，具體信息見表1。

表1 石竹的不同品種信息

A,RW; B,YF; C,狂歡; D,Miss Vanilla; E,紫羅蘭;F,云彤;G,羅西奧; H,MOON GOLEM; I,GF; J,TONIC GOLEM;K,MUTP9;L,BRINA;M,瞿麥;N,云紫云;O,云粉暈;P,云蝶花

圖2 ‘BRINA’花的不同發育時期

1.3 試驗方法1.3.1 色譜條件

經查閱并參考相關文獻[11-13]，最終確定的色譜條件如下：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm)柱；流動相：A相：1.5%磷酸、40%乙腈、50%冰乙酸，B相：1.5%磷酸水溶液，洗脫條件：A相從10%～40%進行梯度洗脫，共30 min，檢測波長為267 nm，柱溫為30 ℃，流速為0.8 mL/min，進樣量為10 μL。

1.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取山奈酚三糖苷對照品20 mg，置于10 mL 棕色量瓶中，加甲醇溶解，定容，制成濃度為2 g/L的對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備

取石竹的新鮮花瓣，用液氮冷凍干燥并迅速研磨粉碎，精密稱取2.0 g放入10 mL溶劑(甲醇90%：冰乙酸10%)中，搖勻，室溫浸提48 h后，補重，離心，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.3.4 專屬性試驗

取對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液(甲醇90%：冰乙酸10%)，按‘1.3.1’項色譜條件進行測定。

1.3.5 標準曲線的制作

取2 g/L的對照品溶液，用甲醇稀釋成系列不同濃度的對照品溶液，按‘1.3.1’項色譜條件進樣測定，得到標準曲線方程。

1.4 方法學考察試驗1.4.1 精密度試驗

取0.5 g/L對照品溶液適量，按‘1.3.1’項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積，計算出相對標準偏差(RSD)值。

1.4.2 穩定性試驗

取石竹花‘BRINA’供試品溶液適量，按‘1.3.1’項下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣測定，合計考察8次記錄峰面積的值。并根據峰面積計算出RSD值。

1.4.3 重復性試驗

精確稱取‘BRINA’供試品2.0 g共6份，按‘1.3.3’項下方法制備供試品溶液，按‘1.3.1’項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并根據數據計算出相關的RSD值。

1.4.4 加樣回收率試驗

共取9份新鮮‘BRINA’供試品，每份精密稱取1.0 g，每3份為一組，每組分別根據樣品中所含目標成分含量的50%、100%、150%精密添加低、中、高3個水平的對照品，按‘1.3.3’項下方法制備供試品溶液，按‘1.3.1’項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率及RSD值。

1.5 石竹中山奈酚三糖苷的含量測定1.5.1 石竹不同品種山奈酚三糖苷含量測定

精密稱取16種不同石竹鮮花樣品，按‘1.3.3’項下方法制備樣品溶液，按‘1.3.1’項下色譜條件進樣測定，并記錄峰面積的值，代入標準曲線方程，得到山奈酚三糖苷的含量。

1.5.2 ‘BRINA’花不同發育時期山奈酚三糖苷含量測定

精密稱取‘BRINA’樣品不同發育時期各3份，按‘1.3.3’項下方法制備樣品溶液，按‘1.3.1’項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積的值，代入標準曲線方程，得到山奈酚三糖苷的含量。

1.5.3 ‘BRINA’不同部位山奈酚三糖苷含量測定

精密稱取‘BRINA’樣品花瓣、花萼、葉、莖不同部位各3份，按‘1.3.3’項下方法制備樣品溶液，按‘1.3.1’項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積的值，代入標準曲線方程，得到山奈酚三糖苷的含量。

2 結果與分析

2.1 專屬性考察結果

按‘1.3.4’測得的HPLC色譜圖見圖3。由圖3可知，在相同的保留時間對照品和供試品均有峰出現，且空白對照溶液對山奈酚三糖苷的測定沒有干擾。

A,對照品溶液; B,石竹樣品溶液; C,空白對照溶液; D,對照品與樣品疊加圖

2.2 山奈酚三糖苷的標準曲線

按照‘1.3.5’試驗方法，以對照品溶液的濃度(g/L)為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，結果見表2。并繪制出相應的標準曲線見圖4，得出回歸方程：山奈酚三糖苷為y=16 840.332 00x+84.737 89，R2=0.999 95，表明對照品在0.063～2.000 g/L的濃度范圍內顯示出良好的線性關系。

圖4 山奈酚三糖苷的標準曲線

表2 山奈酚三糖苷標準曲線試驗結果

2.3 方法學考察結果2.3.1 精密度試驗

連續進樣測定6次，根據試驗結果計算出RSD值為0.48%,見表3。RSD<2%，表明儀器精密度良好。

表3 山奈酚三糖苷的精密度試驗結果

2.3.2 穩定性試驗

根據8次不同時間進樣的峰面積計算出RSD值為1.36%，見表4。RSD<2%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

表4 山奈酚三糖苷穩定性測試結果

2.3.3 重復性試驗

根據6份相同處理方法的供試品的數據，計算出相關的RSD值為1.29%，見表5。RSD<2%，表明該方法重復性良好。

表5 山奈酚三糖苷的重復性測試結果

2.3.4 加樣回收率試驗

根據峰面積，分別計算1∶0.5、1∶1、1∶1.5三組的加樣回收率為101.22%、102.20%和101.24%，RSD值為0.55%，結果見表6。根據試驗結果表明RSD<2%，說明該方法準確度良好。

表6 山奈酚三糖苷加樣回收率測試結果

2.4 石竹中山奈酚三糖苷的含量測定結果2.4.1不同品種的含量測定

根據數據計算出各個供試品的含量，結果見表7和圖5。其中，用abcd等小寫字母標注顯著性差異的方法：首先將全部平均數從大到小依次排列，然后在最大的平均數上標上字母a；并將該平均數與以下各平均數相比，凡相差不顯著的，都標上字母a，直至某一個與之相差顯著的平均數，標記字母b；再以該標有b的該平均數為標準，與上方各個比它大的平均數比較，凡不顯著的也一律標以字母b；再以標有b的最大平均數為標準，與以下各未標記的平均數比，凡不顯著的繼續標以字母b，直至遇到某一個與其差異顯著的平均數標記c,以此類推。從圖5和表7可以看出，以‘云粉暈’樣品中山奈酚三糖苷成分的含量最高為3.866 mg/g，‘瞿麥’的含量次之為3.169 mg/g，“狂歡”的含量最低為0.274 mg/g?！品蹠灐?、‘瞿麥’、‘紫羅蘭’、‘GF’、‘BRINA’5個品種的含量顯著高于其他11個品種。

表7 不同品種花中山奈酚三糖苷的含量測定(n=3)

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);圖中相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.4.2 ‘BRINA’花不同發育時期的含量測定

根據數據計算出各個供試品的含量，結果見表8和圖6(A)。BRINA-花蕾期(2～2.5 cm)含量最高，BRINA-初開期(3～4 cm)含量最低，可以看出隨著花的開放程度，山奈酚三糖苷的含量呈下降趨勢。

表8 ‘BRINA’不同時期的山奈酚三糖苷的含量測定(n=3)

2.4.3 ‘BRINA’不同部位的含量測定

根據數據計算出各個供試品的含量，結果見表9和圖6(B)，花瓣>花萼>葉>莖，花瓣的含量最高，莖含量最低。

表9 ‘BRINA’不同部位的山奈酚三糖苷的含量測定(n=3)

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);圖中相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法及色譜條件的篩選

采用HPLC法測定了不同石竹植物中的山奈酚三糖苷的含量。供試品溶液制備考察了浸提法、超聲提取法對含量的影響，最后確定為浸提法，操作簡單，耗能少，且提取率較高。全波長掃描顯示267 nm處有最大吸收峰，柱溫在30 ℃時分離效果較好且節能，通過參考文獻[11-13]及多次預實驗，最后確定的色譜條件為：A通道流動相：1.5%磷酸、40%乙腈、50%冰乙酸，B通道流動相：1.5%磷酸水溶液，A通道從10%～40%進行梯度洗脫。檢測波長為267 nm, 柱溫為30 ℃，流速為0.8 mL/min，進樣量為10 μL。方法學考察結果表明所用方法準確可靠、重復性好、待測成分不受干擾，可用于石竹中山奈酚三糖苷的含量測定。

3.2 指標成分的選擇

山奈酚三糖苷是石竹的活性成分之一[14]，屬于黃酮醇類化合物。黃酮醇是植物中含量最豐富的類黃酮，通常以單核、二糖苷、三糖苷的形式出現[15]。作為重要的次生代謝物質，黃酮醇廣泛存在于植物各種組織及不同的生長發育階段，參與植物生長發育以及植物應對環境脅迫反應[16]。另外，黃酮醇對人體也有很大的益處，具有抗過敏、抗炎、抗腫瘤等功能。其化學成分含量及藥理活性的研究，可以為含有黃酮醇類的植物提供更高的價值。

3.3 不同石竹中山奈酚三糖苷含量的差異

利用該方法測定并比較了不同品種石竹花中山奈酚三糖苷的含量，測定結果顯示石竹16個品種中均含有山奈酚三糖苷成分，但是不同品種中含量有所差異，以‘云粉暈’樣品中山奈酚三糖苷成分的含量最高，‘瞿麥’的含量次之，‘云紫云’和‘狂歡’的含量最低。其他品種之間含量差異較小?！品蹠灐?、‘瞿麥’、‘紫羅蘭’、‘GF’、‘BRINA’5個品種的含量顯著高于其他11個品種。大體上可以看出Dianthusbarbatus種含量較高，Dianthussuperbus其次，Dianthuscaryophyllus種含量略低。通過不同顏色含量的對比，本研究未發現山奈酚三糖苷的含量與花色有關。

其次又測定了‘BRINA’花不同發育時期的含量，結果顯示花蕾期(2～2.5 cm)含量最高，露色期(2.5～3 cm)含量次之，初開期(3～4 cm)的含量最低?？梢钥闯鲭S著花的開放程度，山奈酚三糖苷的含量呈下降趨勢，且花蕾期、露色期與初開期之間有顯著性差異。最后又測定了‘BRINA’品種不同部位的含量，結果顯示不同組織中活性物質分布存在顯著差異，山奈酚三糖苷具體含量為花瓣>花萼>葉>莖。隨著石竹多元化的功能性產品開發，可以依據不同品種活性成分含量的差異，培育并栽培推廣專用型的石竹品種，也可以根據目標化合物選擇合適的收獲時間以及采收植物的不同部位。使石竹具有更廣泛的市場前景。

4 結論

黃酮醇類物質是石竹的主要活性成分，具有廣泛的的藥理作用。對治療疾病和維持人體健康有很大的益處。建立了一種簡便的、重復性、穩定性、回收率較好的測定石竹中山奈酚三糖苷的方法。測定結果表明，山奈酚三糖苷的積累在不同品種、不同部位以及不同發育時期上都有明顯的差異。隨著花的開放程度，山奈酚三糖苷的含量呈下降趨勢。試驗結果為進一步開發利用石竹植物資源提供實驗基礎和依據。