國產鹽酸溴己新可溶性粉在雞體內的生物等效性評價

孫健，李彥，段笑笑，郭莉莉,4，吳寧鵬，李慧素，楊潔，趙永達,4

(1. 青島農業大學動物醫學院，山東青島 266109； 2. 青島市動物疫病預防控制中心，山東青島 266073；3. 河南省獸藥飼料監察所，河南鄭州 450015； 4. 青島博霖生物科技有限公司，山東青島 266111)

動物呼吸道因直接接觸外界環境，易受環境、氣候變化等因素的影響而誘發各種呼吸道疾病，如肺炎、支氣管炎、支氣管哮喘等。畜禽患呼吸道疾病的常見臨床表現為咳嗽，流鼻涕，伸頸、張口呼吸，帶有呼嚕音或發不出聲音，頻繁甩頭，嚴重時會因痰液過多而呼吸困難。近年來，畜禽呼吸道疾病多發且難以控制，引起呼吸道疾病的主要原因為多種復雜病原體、不利的環境因素、多重混合感染等，禽流感、雞新城疫、傳染性支氣管炎等疾病也會誘發呼吸道癥狀[1]。畜禽類呼吸道疾病除需要對因治療外，還應輔以鎮咳、祛痰、平喘等藥物來緩解呼吸道癥狀。祛痰藥可以促進呼吸道分泌，降低痰液黏稠度，使痰液容易排出。鹽酸溴己新(bromhexine hydrochloride)為半合成的鴨嘴花堿衍生物，最早由德國勃林格殷格翰公司開發，它可直接作用于支氣管腺體，促進黏液分泌，降低痰液黏度，有利于黏痰的咳出[2]，常用于急/慢性支氣管炎、哮喘、支氣管擴張等疾病的治療[3]，歐盟已批準用于牛、豬等畜類和禽類的呼吸道疾病治療[4]。此外，鹽酸溴己新還可增強對抗生素的吸收效果，提高療效[5]。本試驗根據文獻[6]要求，以德國勃林格殷格翰公司生產的鹽酸溴己新可溶性粉為參比制劑，以國產鹽酸溴己新可溶性粉為受試制劑，通過雞血漿中溴己新HPLC-MS/MS測定方法的建立，研究2種鹽酸溴己新可溶性粉的生物等效性，為獸醫臨床鹽酸溴己新可溶性粉的合理使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸溴己新，質量分數99.8%，批號100427-201903，中國食品藥品檢定研究院；受試制劑鹽酸溴己新可溶性粉，規格1%，批號20200319，保定冀中藥業有限公司；參比制劑鹽酸溴己新可溶性粉，規格1%，批號0602506，德國勃林格殷格翰公司；甲醇、乙腈，色譜級，美國Sigma公司；甲酸，色譜級，德國Merck公司；不銹鋼灌胃針，20號90 mm，創博環球(北京)生物科技有限公司；一次性負壓采血管(含肝素鈉)，3 mL，山東奧賽特醫療器械有限公司；水為自制超純水。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜-串聯質譜儀，配電噴霧離子源，Thermo Fisher TSQ Quantiva；3-30K高速臺式離心機，美國Sigma公司；CenLee 4K臺式低速離心機，湖南湘立科學儀器有限公司。

1.3 溶液的配制

鹽酸溴己新標準儲備液(1 mg/mL)：準確稱取鹽酸溴己新11.15 mg于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，-20 ℃保存。

鹽酸溴己新標準中間工作液(10 μg/mL)：準確吸取鹽酸溴己新標準儲備液1 mL于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻?，F配現用。

鹽酸溴己新標準工作液：準確吸取一定量鹽酸溴己新標準中間工作液，用超純水稀釋為所需濃度?，F配現用。

0.1%甲酸乙腈溶液：取乙腈1 000 mL，加入1 mL甲酸，混勻。

30%乙腈溶液(含0.1%甲酸)：取乙腈300 mL，加入0.3 mL甲酸，并用超純水稀釋定容至1 000 mL。

0.1%甲酸水溶液：取甲酸1 mL，用超純水稀釋定容至1 000 mL。

1.4 實驗動物

隨機挑選健康黃羽肉雞(羅斯317)70只，體質量1.5～1.8 kg，雌雄各半，河南后羿生物工程股份有限公司提供。肉雞每天定時給料2次，飼料不含藥物，自由飲水，給藥前適應性飼喂10 d，并記錄雞群每天的精神狀態、飲水、采食等情況。動物房和隔離器使用前用甲醛+高錳酸鉀熏蒸、消毒3 d，隔離器溫度18～25 ℃，相對濕度30%～50%。

1.5 樣品處理與測試條件

1.5.1 樣品處理

血漿樣品自然解凍后，取0.2 mL于離心管中，加入0.1%甲酸乙腈溶液1 mL，渦旋2 min，以10 000 r/min離心10 min。取上清液0.3 mL，加入超純水0.7 mL，混勻，過0.22 μm有機濾膜。

1.5.2 溴己新濃度測定

血漿樣品按1.5.1節方法處理后，使用高效液相色譜-串聯質譜儀分析測定。每批樣品測定前須重新制備空白基質匹配標準曲線，線性范圍0.2～30 ng/mL，并制備500 ng/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL 4個濃度水平的質控樣品。超出檢測線性范圍的，使用空白基質稀釋后重新測定。

1.5.2.1 色譜條件

色譜柱，Waters ACQUITY BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫，30 ℃；進樣量，2 μL；流動相A相為乙腈，B相為0.1%甲酸水溶液；流量，0.3 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.5.2.2 質譜條件

離子源，電噴霧離子源；掃描方式，正離子掃描；檢測方式，多反應監測(multi reaction monitor，SRM)；電離電壓，3.0 kV；鞘氣，20(相對單位)；輔助氣，5(相對單位)；離子遷移管溫度，300 ℃；霧化溫度，350 ℃。定性離子對、定量離子對及碰撞能等參數見表2。

表2 溴己新的定量離子對、定性離子對及碰撞能

1.6 方法學考察

參照文獻[7]進行溴己新濃度測定方法學驗證。

1.6.1 方法特異性考察

取6份來自不同雞的空白血漿，各取0.2 mL，按1.5.1節方法處理，按1.5.2節測試條件測定?？疾毂驹囼灄l件下方法特異性，分析是否存在內源性物質干擾。

1.6.2 基質匹配標準曲線繪制

取8份雞空白血漿，按1.5.1節方法處理，離心后分別取上清液0.3 mL，加入超純水0.65 mL及一定濃度鹽酸溴己新標準工作液0.05 mL，使鹽酸溴己新濃度分別為0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、 1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL，按1.5.2節測試條件測定。以測得的溴己新定量離子峰面積為縱坐標(y軸)，以溴己新濃度為橫坐標(x軸)，1/x2為權重系數，進行線性回歸，繪制基質匹配標準曲線，得回歸方程和相關系數。

1.6.3 檢測限與定量限確定

取雞空白血漿6份，添加不同濃度的鹽酸溴己新標準工作液，按1.5.1節方法處理，按1.5.2節測試條件測定，分別將信噪比>3、信噪比>10確定為檢測限和定量限。

1.6.4 精密度與回收率考察

取雞空白血漿24份，分別添加不同濃度鹽酸溴己新標準工作液，進行鹽酸溴己新濃度分別為5 ng/mL(定量限)、10 ng/mL(低濃度)、100 ng/mL(中濃度)和500 ng/mL(高濃度)的添加回收試驗，計算回收率。每個濃度水平設6個平行樣品，重復3次，每批次間隔1 d以上。計算回收率和精密度平均值及批內、批間變異系數。

1.6.5 反復凍融穩定性考察

取雞空白血漿8份，分別添加一定量鹽酸溴己新標準工作液，配制鹽酸溴己新濃度分別為500 ng/mL(高濃度)和10 ng/mL(低濃度)的血漿樣品，每個濃度4個平行，-20 ℃冷凍12 h，然后取出常溫融化，反復凍融3次，得凍融后血漿樣品。取凍融后血漿樣品0.2 mL，按1.5.1節方法處理，按1.5.2節測試條件測定，考察鹽酸溴己新的穩定性。

1.6.6 樣品溶液儲存穩定性考察

取雞空白血漿12份，分別添加一定量鹽酸溴己新標準工作液，配制鹽酸溴己新濃度分別為500 ng/mL(高濃度)、100 ng/mL(中濃度)、10 ng/mL(低濃度)的血漿樣品，每個濃度4個平行，按1.5.1節方法處理后，所得樣品分別在自動進樣器中4 ℃放置24 h、48 h、72 h，并按1.5.2節測試條件測定，考察樣品溶液中鹽酸溴己新的儲存穩定性。

1.6.7 基質效應考察

取5份來自不同雞的空白血漿，每份一分為二，分別添加一定量鹽酸溴己新標準工作液，配制鹽酸溴己新濃度分別為500 ng/mL(高濃度)、5 ng/mL(低濃度)的血漿樣品，每個濃度5個平行，按1.5.1節方法處理，按1.5.2節測試條件測定，考察不同雞空白血漿的基質效應。

1.6.8 稀釋可靠性考察

取雞空白血漿5份，分別添加一定量鹽酸溴己新標準工作液，配制鹽酸溴己新濃度1 000 ng/mL血漿樣品。取血漿樣品0.2 mL，按1.5.1節方法處理后，用空白基質稀釋10倍制成樣品稀釋溶液，按1.5.2測試條件測定稀釋溶液，考察樣品的稀釋可靠性。

1.6.9 殘留效應考察

在雞空白血漿中添加一定量鹽酸溴己新標準工作液，配制鹽酸溴己新濃度600 ng/mL血漿樣品，按1.5.1節方法處理，按1.5.2節測試條件測定，進樣順序為血漿樣品—空白血漿，考察高濃度血漿樣品進樣后的殘留情況。

1.7 生物等效性試驗

1.7.1 設盲

申請者去除參比制劑、受試制劑外包裝并另行統一包裝，以A、B字母標記區分。設盲人員按照雞編號隨機對應給予A藥或B藥。雞的編號對應的給藥字母作為一級盲底，A和B字母對應的藥物作為二級盲底，分別由設盲人員和申請者保存。

1.7.2 給藥劑量與給藥方法

受試制劑、參比制劑均以鹽酸溴己新可溶性粉計，單次給藥劑量為250 mg/kg。

根據雞體質量，計算并準確稱取受試制劑、參比制劑，分別用超純水溶解并吸取至注射器中，然后給注射器編號，并按照設盲程序，將雞編號與注射器編號對應。給藥時，將注射器中的藥液全部灌入雞胃，再使用3～5 mL生理鹽水沖洗灌胃針并灌入雞胃。給藥過程持續時間不超過1 min，給藥完成后，立即開始計時。

1.7.3 血漿樣本采集

雞采用側臥方式保定，翅下靜脈設置留置針，于采血開始后2 h拆除。每次使用留置針采血時，棄去前端0.5 mL血液，采血后立即向留置針管帽中注入肝素鈉溶液約0.5 mL抗凝。采血分別于給藥前0 min以及給藥后2 min、4 min、8 min、12 min、16 min、20 min、25 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進行，每次采血約1.5 mL至一次性負壓采血管(含肝素鈉)。采集的血漿樣本以4 000 r/min離心10 min，移取上層血漿至帶標記的離心管中，于-20 ℃冷凍保存，作為血漿樣品。

1.8 數據處理

采用Phoenix WinNonlin 5.2.1軟件中的非房室模型，按照采血時間和所測得的溴己新濃度計算鹽酸溴己新在雞體內的藥物代謝動力學參數，包括從0到計算時間(t)藥時曲線下面積(AUC0-t)、從0到無限長時間(∞)藥時曲線下面積(AUC0-∞)、峰濃度(Cmax)、峰時間(tmax)、消除半衰期(t1/2β)等。其中AUC0-t值、AUC0-∞值、Cmax經自然對數轉換后，采用軟件SPSS 22.0多因素方差分析法(ANOVA)進行顯著性檢驗，采用雙側t檢驗法和90%置信區間法評價藥品生物等效性。

2 結果與分析

2.1 方法學驗證

由圖1可知，溴己新保留時間3.5 min，血漿樣品中溴己新與雜質峰分離效果較好，峰形良好，雜質對溴己新的測定無干擾，方法特異性好。

詳細的方法學研究結果顯示：血漿中溴己新濃度為0.2～30 ng/mL時，溴己新濃度與峰面積線性關系良好，相關系數大于0.99；血漿中溴己新檢測限為2 ng/mL，定量限為5 ng/mL；鹽酸溴己新濃度5～500 ng/mL范圍內，批內平均回收率91.6%～116.2%，批內變異系數1.8%～7.8%，批間平均回收率98.1%～110.3%，批間變異系數3.7%～7.7%，變異系數均小于15%，精密度符合要求。結果見表3。

此外，鹽酸溴己新在雞血漿中反復凍融3次后，溴己新穩定性良好，且處理后的樣品溶液4 ℃保存72 h后仍穩定，不同濃度檢測均值與標示濃度的相對標準偏差均小于15%。6份來自不同雞的空白血漿存在不同程度的基質增強效應，定量計算時須采用基質匹配標準曲線進行外標法校正。血漿樣品稀釋10倍后，5份樣品的鹽酸溴己新濃度檢測相對標準偏差為1.68%，表明不存在稀釋效應。殘留效應考察結果顯示，高濃度血漿樣品進樣后，在空白樣品中的殘留小于0.1%，表明本方法殘留效應較小。上述方法學驗證結果說明本方法滿足檢測要求。

2.2 生物等效性試驗結果

2.2.1 兩種鹽酸溴己新可溶性粉在雞體內的藥物代謝動力學參數

通過分析，A組(參比制劑)主要藥物代謝動力學參數為：AUC0-t值(575.55±308.75)h·ng/mL，AUC0-∞值(636.56±325.58)h·ng/mL，Cmax=(164.09±152.04)ng/mL，tmax=(0.86±1.18)h，t1/2β=(4.70±1.95)h。B組(受試制劑)主要藥物代謝動力學參數為：AUC0-t值(551.13±371.33)h·ng/mL，AUC0-∞值(621.18±396.46)h·ng/mL，Cmax=(128.50±83.83)ng/mL，tmax=(0.86±1.32)h，t1/2β=(4.96±2.34)h。參比制劑、受試制劑的主要藥物代謝動力學參數無顯著性差異(p>0.05)。

A. 空白溶劑；B. 空白血漿； C. 添加2 ng/mL鹽酸溴己新血漿樣品；D. 添加5 ng/mL鹽酸溴己新血漿樣品；E. 實測樣品。

表3 雞血漿中溴己新的回收率及精密度

2.2.2 生物等效性分析

經二次揭盲，A藥為參比制劑，灌服A藥的雞為A組，B藥為受試制劑，灌服B藥的雞為B組。兩種制劑的血藥濃度-時間曲線見圖2。

圖2 兩種鹽酸溴己新可溶性粉口服給藥后 在雞體內的濃度-時間曲線

AUC0-t值、AUC0-∞值、Cmax經自然對數轉換后，參比制劑、受試制劑數據間均無顯著性差異(p>0.05)，p值分別為0.52、0.63、0.48。生物等效性分析結果顯示，受試制劑AUC0-t的90%置信區間為95.02%～102.14%，符合在80%～125%之間的要求[6]；AUC0-∞的90%置信區間為95.57%～102.39%，符合在80%～125%之間的要求[6]；Cmax的90%置信區間為93.18%～103.51%，符合在70%～143%之間的要求[6]。

3 討論

鹽酸溴己新是呼吸道疾病輔助性用藥，目前已有鹽酸溴己新在多種動物體內的藥物代謝動力學研究報道，結果說明鹽酸溴己新具有吸收迅速、分布廣泛、蛋白結合率高、血漿清除率低、分布容積大等特征。Iwaki等[8]以大鼠為實驗動物，分別靜脈注射0.3 mg/kg、1 mg/kg劑量的鹽酸溴己新，結果顯示：注射劑量為0.3 mg/kg時，AUC0-∞值為(789±295)h·ng/mL，t1/2β為(9.41±2.26)h；注射劑量為1 mg/kg時，AUC0-∞值為(2 181±425)h·ng/mL，t1/2β為(12.80±4.51)h。Iwaki等[8]還研究了鹽酸溴己新的絕對生物利用度，當按10 mg/kg、25 mg/kg劑量分別給藥后，AUC0-∞值分別為(535±57)h·ng/mL和(1 315±394)h·ng/mL，與靜脈注射1 mg/kg劑量時所得AUC0-∞值比較，得鹽酸溴己新的絕對生物利用度為1.8%±3.9%。絕對生物利用度低可能是由首過效應引起的。

de Backer等[9]采用單交叉試驗設計，分別通過靜脈注射1 mg/kg劑量、口服2 mg/kg劑量2種方式給藥，研究鹽酸溴己新在馬體內的生物利用度。結果顯示：靜脈注射給藥組t1/2β為(3.57±0.59)h，體清除率為(52.93±4.29)mL·kg-1·min-1，表觀分布容積為(16.23±2.25)L/kg，AUC0-∞值為(289.80±21.65)h·ng/mL；口服給藥組tmax為(1.17±0.24)h，Cmax為(13.97±2.71)ng/mL，AUC0-∞值為(33.23±2.71)h·ng/mL，生物利用度為5.73%±0.21%。Vandecasteele-Thienpont等[10]進行了犬體內鹽酸溴己新的生物等效性研究，發現鹽酸溴己新在犬體內的藥物代謝動力學特征符合二室開放模型，口服給藥時生物利用度較低，可能存在首過效應。

Dutta等[11]進行了兔聯合使用阿莫西林和鹽酸溴己新的生物利用度研究，設置3個口服給藥試驗組，分別單獨服用46 mg/kg劑量的阿莫西林、1.5 mg/kg劑量的鹽酸溴己新，以及阿莫西林(劑量46 mg/kg)與鹽酸溴己新(劑量1.5 mg/kg)混合物。結果說明聯合使用阿莫西林和鹽酸溴己新對溴己新tmax、Cmax等參數沒有影響。

根據歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)發布的鹽酸溴己新總結報告可知[4]：鹽酸溴己新口服后能被豬迅速吸收，1～3 h內血藥濃度達到峰值，在第2次或第3次給藥后12 h時，達到穩態血藥濃度；被?？诜蟮臄敌r內，血藥濃度會逐漸升高；被雞或火雞口服后，2～4 h內血藥濃度可達到峰值。鹽酸溴己新有親脂性，對脂質組織有很高的親和力，在這些組織里消耗緩慢。鹽酸溴己新在不同靶動物體內的半衰期不同，在豬體內為20～30 h，在牛體內為40～50 h，在雞或火雞體內為40～50 h。該報告還顯示：豬單次肌肉注射0.5 mg/kg劑量的鹽酸溴己新1.5 h時，血藥濃度達到峰值，t1/2β為7.3 h；注射部位鹽酸溴己新清除迅速，給藥后24 h時，注射部位鹽酸溴己新僅剩余約4%；而對于雞或火雞，按1 mg/kg劑量連續口服5 d，在最后一次給藥后2～4 h時，血藥濃度達到峰值。

本文建立的雞血漿中溴己新濃度測定方法穩定性好，準確度、精密度、檢測限和定量限均滿足生物樣品定量分析要求，可為鹽酸溴己新可溶性粉在雞體內生物等效性研究提供可靠的濃度測定方法。根據該方法，測得國產鹽酸溴己新可溶性粉、德國勃林格殷格翰公司生產的鹽酸溴己新可溶性粉2種制劑在雞體內的tmax、Cmax及藥時曲線下面積等參數均無顯著性差異，說明兩者具有生物等效性，有相似的臨床療效。另外，藥物代謝動力學參數tmax與文獻[8-10]數據略有差異，可能與靶動物品種有關。