復發性流產絨毛組織中MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p表達水平及與血管新生的相關性

葉彩云 高翠玲 張 藝 張 繼

河南省鄭州市第七人民醫院(450000)

與同一配偶連續發生≥2次自然流產被定義為復發性流產(RSA)。RSA對育齡女性造成生育困擾，由于RSA的致病機制尚不明確，其治療一直是臨床難題[1]。隨著醫學研究的進步，miRNA被證實參與各種生理及病理過程，與細胞分化、增殖、凋亡等多種生理活動密切相關[2]。有研究發現，miRNA與不育癥[3]、子宮內膜異位癥[4]等生殖系統性疾病之間存在聯系。Zhao等[5]研究發現，原因不明性復發性流產(URSA)患者蛻膜組織內MicroRNA-146a-5p水平異常下調，且可能通過增強IFN-γ活性，參與URSA；Wen等[6]研究發現，過表達MicroRNA-515-5p可降低細胞活力，促進細胞凋亡，抑制細胞增殖。血管生成在妊娠中發揮重要作用，而血管內皮生長因子(VEGF)是血管生成的主要作用因子，在維持妊娠中具有重要作用[7]。目前關于RSA患者絨毛組織內MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p表達水平，及其與新生血管間關系尚不明確，基于以上背景開展本研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象

將2018年1月～2020年12月本院收治的RSA 84例(RSA組)以及自愿行流產手術的正常妊娠婦女60例(對照組)納為研究對象。納入標準：①RSA患者既往自然流產史≥1次；此次妊娠亦診斷為自然流產；孕周7～10周；B超未見胎心搏動；絨毛、蛻膜病檢提示絨毛形態正常。②對照組年齡、孕周與RSA組匹配；既往無不良孕史；此次妊娠無先兆流產癥狀；B超檢查可見胎芽及胎心搏動；絨毛、蛻膜病檢提示絨毛形態正常。排除標準：平時月經紊亂者；本次妊娠期間有急慢性感染史；合并自身免疫性疾??；生殖道畸形；內分泌異常；酗酒、吸煙、吸毒等不良習慣。本研究經本院倫理委員會審批，納入對象均簽署知情同意書。

1.2 絨毛標本采集

流產手術均由資歷相當的醫務人員完成，術后收集絨毛組織投入已進行DEPC處理的凍存管內，-80℃保存待用。

1.3 實驗儀器與試劑

①試驗儀器：熒光定量PCR儀(美國ABI)、-80℃超低溫冰箱(日本松下)、紫外線分光光度儀(美國Beckman)、低溫臺式離心機(德國Eppedorf)、電泳儀(北京六一儀器)、垂直平板電泳槽(美國Bio-Rad)。②實驗試劑：MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p、VEGF逆轉錄引物由廣州銳博生物科技有限公司合成；逆轉錄試劑盒購自美國Thermo公司，qPT-PCR引物購自廣州銳博，VEGF抗體、U6抗體、β-actin抗兔二抗均購自美國Bioworld公司，DBA顯色試劑盒購自長沙艾杰生物技術有限公司。BCA標準蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司。

1.4 實時熒光定量法(PCR)

①提取絨毛組織總RNA并檢測純度，取1μl樣本，微量紫外分光光度計在260nm與280nm波長處測量其OD值，若OD值在1.8～2.0為合格。②逆轉錄為cDNA：使用MMLV逆轉錄酶oligo(dT)引物，按照Prime ScriptTM RT Reagent Kit 說明書方法將RNA逆轉錄為cDNA，并以此為模型行qPCR。③MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p、VEGF及U6的正向引物序列分別為：5’-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3’、5'-TTCTCCAAAAGAAAGCACTTTCTG-3',5’-ATGACGAGGGCCTGGAGTGTG-3’、5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物為通用反向引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。引物由廣州銳博生物科技有限公司合成。④PCR擴增，總反應體系20μl，包括2×SYBR Green qPCR Mix 10μl，Forward primer 0.7μl，Reverse primer 0.7μl，cDNA 3.0μl，RNase-free H2O 5.6μl，95℃ 3min預變性，每個循環變性95℃ 10s，引物58℃退火延伸，35個循環。以U6為內參，采用2-△△CT法對RNA表達進行相對定量。

1.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)

絨毛組織研磨為粉末，根據組織大小加入一定體積裂解液充分裂解，95℃5min使蛋白變性。根據相關步驟制作10%SDS-PAGE膠，取24μg總蛋白含上樣緩沖液，總體積30μl，90V電泳30min，待至分離膠時，120V電泳60～90min，90V，轉膜后添加脫脂奶粉封閉1h，TBS液清洗，滴加一抗(MicroRNA-146a-5p 1：200，MicroRNA-515-5p 1：200，VEGF 1:400，β-actin1:5000)，4℃過夜；添加二抗，室溫孵育1～2h，化學發光法顯色，顯影、定影，凝膠成像掃描系統掃描，ImageJ圖像軟件分析，得出各條帶所對應的灰度值計算相關灰度值。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 一般資料

RSA組年齡(28.4±2.1)歲(25～31歲)，孕周(8.7±1.5)周(7～10周)，流產史(1.7±0.4)次(1～7次)；對照組年齡(29.5±3.3)歲(22～33歲)，孕周(9.0±0.4)周(7～10周)。兩組年齡及孕周無差異(P>0.05)。

2.2 PCR檢測

RSA組MicroRNA-146a-5p(0.48±0.16)及VEGF mRNA(0.31±0.08)表達量均低于對照組MicroRNA-146a-5p(1.03±0.17)和VEGF mRNA(1.03±0.18)，MicroRNA-515-5p mRNA表達量(1.29±0.26)高于對照組(0.47±0.15)(均P<0.05)。

2.3 Western Blot檢測

Western Blot檢測結果見圖1。RSA組患者絨毛組織內MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p蛋白表達量均高于對照組，VEGF蛋白表達量低于對照組(P<0.05)。

圖1 絨毛組織內MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p及VEGF蛋白表達

2.4 不同流產次數RSA患者MicroRNA-146a-5p及MicroRNA-515-5p表達水平

隨著流產次數的增加，RSA患者MicroRNA-146a-5p(0.69±0.20)、VEGF mRNA(0.56±0.11)表達量依次下降為MicroRNA-146a-5p(0.36±0.09)、VEGF mRNA(0.16±0.04)，MicroRNA-515-5p mRNA表達量(1.02±0.23)上升為(1.57±0.29)(均P<0.05)。見圖2。

圖2 不同流產次數RSA患者絨毛組織內MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p及VEGF蛋白表達

2.5 RSA組MicroRNA-146a-5p及MicroRNA-515-5p與VEGF關系

RSA組MicroRNA-146a-5p表達量與VEGF呈正相關(r=0.53,P<0.05)，MicroRNA-515-5p與VEGF呈負相關(r=-0.49,P<0.05)。

3 討論

有80%的RSA患者在妊娠12周前發生流產，RSA給育齡女性帶來極大身心痛苦。引起RSA的因素較多，除染色體異常、生殖器畸形、自身免疫性疾病、內分泌疾病外，還有50%的RSA原因不明[8-9]。積極探索RSA的可能機制，是臨床治療RSA的基礎。

miRNA是一類長度較短的非編碼RNA，被證實與多種疾病密切相關，其中也包括女性生殖性疾病。Zhao L等[6]研究發現，URSA患者蛻膜組織中Micr-146a-5p水平低于健康女性，Micr-146a-5p mRNA表達水平與IRAK1及TRAF6呈負相關，Micr-146a-5p可能通過增強IFN-γ活性導致胎盤免疫不耐受，進而導致流產。本研究發現，與健康婦女組相比，RSA患者絨毛組織內Micr-146a-5p mRNA及蛋白表達水平均降低，提示Micr-146a-5p可能參與了RSA發生。

MicroRNA-515-5p被證實與乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種癌變密切相關[10-12]。張榮枝[13]等研究發現，高表達的MicroRNA-515-5p能促進直腸癌細胞凋亡，降低細胞存活率。提示MicroRNA-515-5p可能參與了細胞的增殖和凋亡。RSA與滋養層細胞凋亡關系密切。本研究發現，RSA患者絨毛組織內MicroRNA-515-5pmRNA及蛋白表達水平高于對照組，說明MicroRNA-515-5p可能也參與了RSA發生。

血管生成是妊娠重要的生理機制，受精卵著床及胎盤循環建立均與生理機制密切相關。VEGF能促進內皮細胞增生與血管增生，增強血管通透性，改變細胞外基質[14]。有研究表明[15]，VEGF表達異常將造成胚胎血管生成障礙，最終導致血供不足，胚胎停止發育與自然流產。本研究發現，與對照組相比，RSA組患者絨毛組織內VEGF mRNA及蛋白表達量均明顯下降。提示VEGF水平下降可能是引起RSA的一個原因。

此外，本文發現，RSA患者絨毛組織Micr-146a-5p與VEGF水平呈正相關，MicroRNA-515-5p水平與VEGF水平呈負相關。說明Micr-146a-5p水平降低、MicroRNA-515-5p水平升高，可能通過影響VEGF引起流產，共同參與RSA。但以上推論需進一步研究加以證實。

綜上所述，RSA患者絨毛組織Micr-146a-5p表達下降，MicroRNA-515-5p表達上升，與VEGF表達存在相關性，推測Micr-146a-5p、MicroRNA-515-5p可能通過影響血管生成而引起流產，但具體作用機制需深入研究。