THADA基因多態性及外周血FFA、irisin與多囊卵巢綜合征發病風險的相關性

董延華 樊 榮

鄭州大學第三附屬醫院(450000)

多卵巢綜合征(PCOS)是女性常見的高度異質性內分泌紊亂性疾病，是不孕主要病因。隨著病情進展，出現胰島素抵抗(IR)、高血脂癥等代謝紊亂性表現[1-2]。遺傳因素在疾病的發病機制中起著至關重要作用[3]。THADA是PCOS易感基因，其SNP位點rs13429458可能通過抑制胰島素調節血糖，與IR關系密切，而IR是PCOS發生發展的病理生理基礎[4]。此外，與IR及血糖代謝相關的生化指標可能與PCOS也存在密切聯系。外周血游離脂肪酸(FFA)及irsin均與IR及血糖代謝關系密切。FFA在正常人體內含量不高，能通過多種途徑阻礙胰島素的生理作用，參與IR[5]。irisin細胞因子是Ⅲ型纖連蛋白水解酶水解后被釋放到循環系統內的多肽片段，外源性給予irisin能有效增加動物能量消耗，改善糖尿病模型大鼠的糖耐受情況[6]。有研究證實[7]，應用二甲雙胍能有效提高T2DM患者irisin水平，減輕機體氧化應激反應。但目前，關于THADA基因多態性及外周血FFA、irsin與PCOS之間的關系尚不明確，為此開展本研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象

將本院2018年1月-2021年1月收治的PCOS患者112例納為觀察組，80例因男方因素不孕的同齡婦女納為正常組。納入標準：①PCOS符合中國診療指南中相關診斷標準[8]；②對照組月經規律、排卵正常；③漢族，年齡21～35歲。排除標準：合并急慢性疾病、參與研究前3個月內創傷史、合并惡性腫瘤以及免疫性疾病史、近3個月內服用激素、降糖及降脂類藥物。本研究經醫院倫理委員會批準，參與者均知情且同意。

1.2 THADA基因多態性檢測

采集被納入對象外周血，-80℃保存待用。4℃解溶，在EDTA抗凝管中分裝，按照外周血基因組DNA試劑盒相關說明提取外周血基因組DNA。DNA鑒定：核酸蛋白定量儀分別在260nm、280nm處吸光度值，計算吸光度比值估算核酸純度，基因組DNA樣本中吸光度比值>1.8即合格。含溴乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳，以DL2000 DNA Marker作為標記，電泳參數：120V恒壓電泳30min，電泳完畢后使用凝膠成像儀觀察并保存。引物序列：在Gene bank中尋找rs13429458序列，根據Primer 5.0軟件設計引物序列，上海生工生物工程技術有限公司合成，rs13429458上游引物：5’-CAAGTCTTGGTCACAATCCAGGG-3’，下游引物：5’-CAAR ARARRCCAAATGAATGCACAATGGAGA-3’，大小為248 bp，退火溫度55℃。PCR擴增實驗：取0.6μl基因組DNA作為模板，采用rs13405728的特異性引物PCR擴增，反應體系總體積30μl，包括10×Pfu Buffer 3 μl，dNTP Mix(10 mM)0.6 μl，模板0.6 μl，Pfu Polymerase(2.5 U/μl)0.3 μl，ddH2O 24.3 μl。PCR反應程序：預變性95℃ 5min，變性95℃30s，退火60℃ 30s，延伸72℃ 30s，總延伸72℃ 7min，35個循環。含溴乙錠的1%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳條件同上。酶切檢測：rs13405728位點的限制性內切酶為H py 188Ⅲ，配置25μl酶切體系，包括10×NE Buffer、PCR產物以及水。將配置好的酶切體系置于PCR儀，37℃反應6min，65℃ 20min，酶切產物用含溴乙錠的3%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件同上。

1.3 外周循環血FFA以及irisin檢測

采集納入對象空腹外周靜脈血離心分離血清，采用酶聯免疫吸附法檢測血清FFA、irisin水平，試劑盒購均購自美國BPB公司，FFA批內CV% 3.59～7%、批間CV%<5.2～8.1%，irisin批內CV% 4.3～8.2%、批間CV%<5.5～7.8%。

1.4 糖耐受試驗及胰島素抵抗

FPG及FINS水平檢測分別采用口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)以及胰島素釋放試驗(IRT)檢驗，計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=FPG(mmol/L)×FINS(mIU/L)/22.5。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 THADA基因多態性發生頻率比較

Hardy-Weinberg平衡試驗結果提示，觀察組及正常組患者THADA基因SNP位點rs13429458型基因型頻率分布的實際值與理論值均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，說明吻合度檢驗較好(P>0.05)，所納入的研究群體具有代表性。

2.2 rs13429458基因型及等位基因分布頻率比較

rs134294858基因型分布及等位基因頻率觀察組與正常組有差異(P<0.05)。見表1。

表1 兩組rs13429458基因型及等位基因分布頻率比較[例(%)]

2.3 PCOS患者rs13429458基因多態性與臨床特征關系

比較發現，PCOS患者中，THADA基因 rs13429458位點TG+GG型與TT型患者多毛評分(FG)、黃體生成素(LH)/卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、睪酮(T)、孕酮(P)、甘油三酯、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平及腰臀比無差異(P>0.05)，而TG+GG型患者體質指數(BMI)及IR占比均高于TT型患者(P<0.05)。見表2。

表2 PCOS患者rs13429458基因多態性與臨床特征關系分析

2.4 PCOS患者rs13429458基因多態性與血糖代謝關系

PCOS患者中，TG+GG型患者基因胰島素0、30、60、120、180mIU/L，血糖30、60、120mmol/L以及HOMA-IR均高于TT型患者(P<0.05)，血糖0、180兩種型患者無差異(P>0.05)。見表3。

表3 PCOS患者rs13429458基因多態性與血糖代謝關系分析

2.5 外周血FFA、irisin水平比較

觀察組外周血FFA水平(0.63±0.16μmol/L)高于正常組(0.54±0.15μmol/L)，isin水平(153.14±36.45μg/L)低于正常組(218.47±33.74μg/L)(t=3.943、12.625，均P<0.001)。PCOS中存在IR患者外周血FFA水平(0.73±0.15μmol/L)高于非IR患者(0.56±0.13μmol/L)，irisin水平(136.49±22.44μg/L)低于非IR患者(164.74±23.79μg/L)(t=6.389、6.327，均P<0.001)，TG+GG基因型患者外周血FFA水平(0.72±0.16μmol/L)高于TT基因型患者(0.59±0.14μmol/L)，irisin水平(137.13±22.05μg/L)低于TT型患者(160.12±23.16μg/L)(t=4.324、4.900，均P<0.001)。

3 討論

IR以及高胰島素血癥是PCOS及T2DM的共同病因，對于PCOS患者來講，IR以及高胰島素血癥不僅是其糖代謝異常的基本特征，IR還可通過誘發高雄激素血癥，并對卵泡發育及子宮內膜生長產生負面影響，進而導致PCOS生殖障礙[9-10]。PCOS與遺傳因素密切相關，THADA是與 2號染色體p21位點關系最為密切的PCOS易感基因，本研究發現，PCOS患者THADA基因SNP位點rs13429458基因型與正常組相比差異明顯，TG基因型明顯多于正常組，等位基因G的頻率高于正常組；PCOS患者THADA基因SNP位點rs13429458的TG+GG基因型患者胰島素0、30、60、120、180、血糖30、60、120以及HOMA-IR、BMI水平均高于TT基因型患者，提示易感基因THADA SNP的突變可能通過影響糖代謝促進IR，參與PCOS的致病機制。

FFA是血清中未與甘油、膽固醇等脂化的脂肪酸，反映脂代謝紊亂靈敏度優于HDL、LDL以及甘油三酯；此外，FFA可通過影響葡萄糖代謝途徑，促進前炎癥調控因子轉錄、誘導內質網應激、激活炎性因子等方式，干擾胰島素作用，導致葡萄糖無法正常代謝進而形成IR[11-12]。本研究發現，PCOS患者血清FFA水平高于正常組，且合并IR患者高于非合并NIR患者、THADA基因 SNP位點rs13429458 TG+GG基因型患者TT型患者，提示PCOS患者外周血FFA水平降低，且在合并IR者及THADA基因突變者中更為嚴重，分析認為THADA SNP突變還可能通過增加FFA含量促進IR。

irisin是近年來新發現的肌源性細胞因子，廣泛分布于人體各個組織及器官，能誘導白色脂肪釋放能量轉化為棕色脂肪，進而增加耗能，減輕體重[13-14]。有動物實驗表明[15]，給予外源性irisin能有效改善T2DM小鼠糖代謝及IR狀況。本研究發現，與正常組相比，觀察組血清irisin水平降低，且在合并IR以及THADA基因SNP位點rs13429458的TG+GG基因型患者中更明顯。提示THADA基因突變還可能通過降低血清irisin水平，加重血糖代謝紊亂，促進IR。

受限于本研究設計及研究條件，本文未對THADA基因突變在增加外周血FFA水平、降低irisin水平，促進IR中的具體機制進行探究，可作為下一步研究方向。

綜上所述，易感基因THADA SNP突變可能通過影響糖代謝，增加外周血FFA水平，降低irisin水平，共同促進IR，參與PCOS的致病機制。