具有光協同抗菌作用納米銀復合材料的制備

劉天宇，徐 麗，錢澤丹，沈穎欣，龐千粵，盧晴風，劉 意1,*

（1.廣東藥科大學 藥學院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥科大學 醫藥化工學院，廣東 中山 528458）

細菌在環境中普遍存在，目前最有效的治療細菌感染的方法是使用抗生素；然而抗生素的使用不可避免地導致耐藥菌株出現，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐萬古霉素金黃色葡萄球菌［1］。在過去的幾十年里，抗生素耐藥基因的出現［2］，導致危及生命的感染增加，已經成為嚴重的公共衛生負擔，因此，迫切需要找到一種抗生素替代品［3］。

目前，已經報道了多種能替代抗生素的材料［如金屬離子、銀納米顆粒（AgNPs）［4］、金屬氧化物納米顆粒［5］、石墨烯、納米碳和季銨化合物［6］］，這些新材料可以降低或抑制細菌的活力。作為廣譜抗菌劑［7］的AgNPs已獲得美國食品藥品管理局批準并廣泛應用于抗菌敷料領域［8］。雖然AgNPs可以達到令人滿意的抗菌效果，但一些含銀敷料或軟膏由于銀離子的突量釋放具有極高的生物毒性［9］，因此，控制銀離子的釋放量成了含AgNPs抗菌劑需要克服的主要問題［10］。另外，因AgNPs常規情況下呈現易于聚集的趨勢，導致抗菌性能降低［11］。為解決這些問題，有必要為AgNPs找到合適的表面鈍化或支持材料，在保持其抗菌活性的同時具有更好的生物相容性［12］。

光協同抗菌材料也是當前研究的一大熱點，使用對可見光響應的光敏劑，可以從周圍的分子氧中產生活性氧（ROS），起到抗菌的作用［13］。經典的光敏劑包括四吡咯、酞菁、吩噻嗪、亞甲基藍等，但它們存在低水溶性、較差分散性、復雜的合成路線和低生物相容性等缺點，限制了在臨床上的應用。

碳量子點（CQDs）在可見光區域內有響應，具有用作光敏劑的潛力，同時，基于CQDs的納米復合材料在抗菌方面也具有優勢。CQDs是一種新型的無金屬熒光納米粒子，具有合成簡單、毒性低、生物相容性好、易于表面修飾［14］等優點，已廣泛應用于成像、傳感、催化等領域［15-18］。CQDs也被作為抗菌劑研究。一方面由于CQDs表面所帶電荷不同，對不同種類細菌表現出不同的抗菌效果，帶正電的CQDs誘導內源性ROS的能力明顯高于帶負電的CQDs。摻雜其他元素的CQDs對細菌具有生長抑制作用，可能是由于高正電荷破壞了細菌膜［19］；另一方面，CQDs的殺菌活性還取決于它們的表面化學基團和尺寸。本工作利用CQDs的特性，采用原位法制備AgNPs@硫氮摻雜碳量子點（S,N-CQDs）復合材料，試圖實現AgNPs與S,N-CQDs良好的光協同抗菌作用，并解決傳統銀離子抗菌劑的生物毒性，提高生物相容性，擴大納米銀基復合材料的應用范圍。

1 實驗部分

1.1 主要試劑

檸檬酸（CA），β-巰基乙胺，硝酸銀：均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司。營養瓊脂，溶菌肉湯培養基（LB），沙氏葡萄糖液體培養基，馬鈴薯葡萄糖瓊脂：廣東環凱微生物科技公司。金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，MRSA，白色念珠菌：廣東文睿生物有限公司。

1.2 試樣制備

1.2.1 S,N-CQDs的制備

將0.600 g CA和0.195 g β-巰基乙胺溶于10 mL純水中，然后轉移到50 mL聚四氟乙烯中，將其置于不銹鋼反應器加熱至150 ℃，反應3 h。反應結束后冷卻至室溫，形成棕黃色溶液，在透析袋（截留相對分子質量1 000）中透析24 h，每4 h換一次水，將透析液冷凍干燥得到固體，即S,N-CQDs。

1.2.2 AgNPs@S,N-CQDs的制備

稱取定量S,N-CQDs溶于去離子水中，質量濃度為1 mg/mL，共100 mL；稱取質量濃度為20 mg/mL的硝酸銀溶液，在磁力攪拌條件下，向S,NCQDs溶液中加入5 mL硝酸銀溶液。連續攪拌48 h后，得到淡黃色溶液。透析48 h除去未反應的銀離子，在此期間每6 h換一次水。所得溶液經過濾、冷凍、干燥，得到淡黃色AgNPs@S,N-CQDs顆粒。

1.3 測試與表征

納米顆粒的結構采用日本島津制作所的UV-2600型紫外-可見分光光度計檢測，200～800 nm紫外吸收光譜。傅里葉變換紅外光譜（FTIR）采用日本島津制作所的IR Affinity-1型傅里葉變換紅外光譜儀測試，波數為500～4 000 cm-1。納米顆粒形貌和粒徑采用日本株式會社日立制作所的H-7650型高分辨透射電子顯微鏡觀察。

1.4 抗菌性能測試

1.4.1 最小抑菌濃度（MIC）檢測

實驗前，固體培養基上的細菌，包括金黃色葡萄球菌、MRSA和大腸桿菌，在液體LB中培養24 h，白色念珠菌在沙氏葡萄糖液體培養基中培養24 h。在無菌96孔板中，每孔加入100 μL LB，在第一孔加入100 μL一定濃度的S,N-CQDs或AgNPs@S,N-CQDs復合材料，混合均勻后吸取100 μL至第二孔中，重復此步驟至最后一孔，棄去第十二號孔吸取的100 μL，各孔加入100 μL濃度為2×105CFU/mL的菌懸液。MIC通過濁度法測量，對應無渾濁孔的CQDs或AgNPs@S,N-CQDs復合材料的濃度即為MIC值。所有實驗平行測三次。

1.4.2 光協同抑菌率檢測

將S,N-CQDs和AgNPs@S,N-CQDs復合材料與不同種類細菌在不同濃度下共培養后，采用420 nm光源改變光照功率和光照時間，進行抑菌率測試實驗。以MRSA為例進行實驗：進行抑菌率平板實驗前，將固體培養基上的MRSA在LB中培養24 h；然后將AgNPs@S,N-CQDs復合材料或S,NCQDs與細菌混合，使最終系統中的細菌濃度保持在1×105CFU/mL，AgNPs@S,N-CQDs復合材料或S,N-CQDs的質量濃度為0.050 mg/mL，平板涂布，利用420 nm光源采用6 W或15 W光照0，1，2，3，4 min，在37 ℃恒溫孵育箱中培養24 h，統計各平板的菌落數，按式（1）計算抑菌率。然后固定15 W光照功率和3 min光照時間，改變AgNPs@S,N-CQDs或S,N-CQDs濃度，使最終系統中的細菌濃度保持在1×105CFU/mL，試樣質量濃度為0.010，0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800 mg/mL，在37 ℃恒溫孵育箱中培養24 h，試樣組為AgNPs@S,NCQDs復合材料或S,N-CQDs，對照組為與試樣組等量的LB，統計各平板菌落數，并計算抑菌率。

1.5 溶血實驗

將定量2%（w）血細胞以5 000 r/min的速率離心5 min，棄去上清液，收集血細胞，加入定量滅菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS），重懸后同樣條件離心，重復三次，將血細胞分散在含有AgNPs@S,N-CQDs或S,N-CQDs的PBS緩沖溶液中，最終體系中血細胞質量分數為1%，AgNPs@S,N-CQDs或S,N-CQDs濃度為0.010，0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800 mg/mL，陰性對照組為同體積PBS緩沖溶液，陽性對照組為同體積的高濃度AgNPs@S,N-CQDs水溶液，在37 ℃恒溫水浴鍋孵育2 h。最后，將血細胞在5 000 r/min離心5 min，測定上層清液在波長540 nm處的吸光度，按式（2）計算溶血率。

式中：OD540（試樣）為試樣在540 nm處的吸光度；OD540（陰性對照）為陰性對照組在540 nm處的吸光度；OD540（陽性對照）為陽性對照組在540 nm處的吸光度。

2 結果與討論

2.1 AgNPs@S,N-CQDs復合材料的表征

從圖1可以看出：S,N-CQDs在230～250 nm及350 nm處有紫外特征吸收肩峰，歸因于C=O的n-π*躍遷，AgNPs@S,N-CQDs在400 nm處存在紫外吸收峰，當AgNPs存在時會在400 nm左右產生紫外特征吸收峰，說明AgNPs@S,N-CQDs已成功合成。從圖1還可以看出：3 000～3 500 cm-1的寬吸收帶是由于O—H和N—H的拉伸振動，表明S,NCQDs表面有許多氨基和羥基，說明S,N-CQDs和AgNPs@S,N-CQDs具有良好的親水性；而2 600 cm-1處的吸收峰歸因于巰基，1 726 cm-1處的吸收峰歸因于C=O的拉伸振動，說明AgNPs與S,NCQDs中含氧官能團（即—COOH）存在相互作用，是通過形成化學鍵或靜電吸引來實現的，1 380 cm-1處的吸收峰歸因于S=O的拉伸振動，AgNPs@S,N-CQDs在此處的峰變尖銳，說明S=O的斷裂，結合1 654 cm-1處出現的峰，說明AgNPs負載在S,N-CQDs上。

圖1 S,N-CQDs和AgNPs@S,N-CQDs的紫外吸收光譜和FTIRFig.1 UV absorption spectra and FTIR spectra of S,N-CQDs and AgNPs@S,N-CQDs

2.2 高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）觀察

從圖2可以看出：AgNPs被包裹在S,N-CQDs之間，分散性良好，顆粒呈類球形，粒徑均一，平均粒徑為5 nm；0.238 nm晶格間距是Ag的（111）特征晶格間距，表明成功合成了AgNPs@S,NCQDs復合材料。

圖2 AgNPs@S,N-CQDs復合材料的HRTEM照片Fig.2 HRTEM image of AgNPs@S,N-CQDs

2.3 抗菌性能

從表1可以看出：S,N-CQDs同樣具有廣譜抗菌性能，對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）、陰性菌（大腸桿菌）、耐藥菌（MRSA）、真菌（白色念珠菌）的代表性菌種都能起到抗菌作用；與S,NCQDs相比，由于引入AgNPs@S,N-CQDs的MIC值較低，說明AgNPs@S,N-CQDs的抗菌性能明顯強于S,N-CQDs，表明AgNPs@S,N-CQDs在抗菌性能方面優勢明顯。

表1 AgNPs@S,N-CQDs及S,N-CQDs針對不同種細菌的MIC值Tab.1 MIC values of AgNPs@S,N-CQDs and S,N-CQDs against different kinds of bacteria mg/mL

2.4 光協同抑菌

從圖3可以看出：光照條件下，對照組抑菌率隨著光照時間或光照功率的增加而增大，單獨光照情況下同樣可以產生一定程度的抑菌作用。與對照組相比，由于S,N-CQDs本身具有抗菌性能，故在光照時其抑菌率較高；AgNPs@S,N-CQDs在光照時表現出較對照組和S,N-CQDs更好的抗菌性能，隨著光照時間和光照功率的增加，抗菌效果也越來越明顯。

圖3 不同光照功率和時間下S,N-CQDs與AgNPs@S,N-CQDs對MRSA的抑菌率Fig.3 Inhibition rate of AgNPs@S,N-CQDs against MRSA under different light time and different light intensity

從圖4可以看出：在15 W光照功率和3 min光照時間條件下，通過計算抑菌率已接近80%，表現出優異的光協同抗菌作用。在固定光照時間和光照功率條件下，改變AgNPs@S,N-CQDs或S,NCQDs濃度，抑菌率也隨之改變。從圖5可以看出：在0.050 mg/mL AgNPs@S,N-CQDs存在條件下，光照功率和光照時間固定時，抑菌率已接近80%，菌落數明顯減少，能有效抑制MRSA的生長，說明在該光源激發情況下，AgNPs@S,N-CQDs有較強的光協同抗菌作用。

圖4 不同濃度AgNPs@S,N-CQDs條件下采用15 W光照3 min平板實驗圖片Fig.4 Plate pictures about different concentrations of AgNPs@S,N-CQDs with 15 W light for 3 min

圖5 不同濃度AgNPs@S,N-CQDs條件下采用15 W光照3 min的抑菌率Fig.5 Inhibition rate of different concentrations of AgNPs@S,N-CQDs with 15 W light for 3 min

2.5 溶血實驗

將血細胞與不同濃度的AgNPs@S,N-CQDs或S,N-CQDs培養2 h后，從圖6和圖7可以看出：陽性對照組呈現明顯的溶血現象。當AgNPs@S,NCQDs質量濃度低于0.200 mg/mL時，溶血率低于5%，即便當AgNPs@S,N-CQDs質量濃度為0.400 mg/mL時，也無誘導溶血現象，因此AgNPs@S,NCQDs的生物相容性良好。

圖6 不同濃度AgNPs@S,N-CQDs的溶血圖像Fig.6 Hemolysis images of AgNPs@S,N-CQDs on red blood cell with different concentrations

圖7 不同濃度AgNPs@S,N-CQDs的溶血率Fig.7 Hemolysis ratio of AgNPs@S,N-CQDs on red blood cell with different concentrations

3 結論

a）采用原位法制備了AgNPs@S,N-CQDs復合材料，復合材料中AgNPs呈類球形，分散均勻，平均粒徑5 nm。

b）AgNPs@S,N-CQDs復合材料具有良好的抗菌性能及廣譜抗菌特性，在光照刺激下具有光協同抗菌作用。當復合材料質量濃度為0.050 mg/mL，波長為420 nm，光照功率為15 W，光照時間為3 min時，對MRSA的抑菌率可達80%，能有效抑制MRSA的生長。

c）當AgNPs@S,N-CQDs復合材料質量濃度為0.400 mg/mL時，也幾乎不會誘導溶血，說明其具有良好的生物相容性。